红细胞CD59分子及其基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性

胡金川，夏建军，陈松楠，张立敏，田亚平

系统性红斑狼疮(SLE)是一种常见的慢性自身免疫性疾病，主要发生于15～40岁女性，中国SLE患病率为(30.13～70.41)/10万[1-2]。SLE临床表现呈多样性，发病率虽不高，但具有潜在致命性，严重影响患者特别是育龄女性的生活质量。缺乏理想的SLE活动性或治疗反应标志物是有效管理疾病、研发药物及发展新疗法的障碍[3]，故寻找用于SLE诊断和病情监测的理想标志物十分必要。目前已经确认补体调节蛋白在免疫紊乱性疾病中的作用和补体抑制剂作为治疗药物的重要性。CD59是18～20 kDa的GPI锚定蛋白，存在于多数循环细胞和组织细胞膜上，它是4种主要的膜结合补体调节蛋白之一，通过结合C8和(或)C9、干扰C9膜插入及与C5b-8聚合而阻止膜攻击复合物C5b-9形成，有效保护自体细胞免受补体介导的损害[4-7]。SLE患者CD59分子水平的变化特点及CD59基因单核苷酸多态性(SNP)与SLE易感性的关联值得关注。本研究对SLE患者和健康人群红细胞CD59分子水平及CD59基因7个标签SNP位点基因型及等位基因分布特点进行研究，以期寻找SLE早期筛查、诊断标志物，为SLE发病机制和新疗法研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集解放军总医院2008年2月—2009年1月诊治的119例SLE作为SLE组，其中男17例，女102例；年龄13～74(30.0±15.5)岁；病程0.5～9.0(4.88±2.17)年。纳入标准：符合2019年欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病学会分类标准。排除标准：合并其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤者，合并严重细菌、真菌感染者，妊娠期妇女。另将同一时期来院体检的健康者117例作为对照组，其中男14例，女103例；年龄17～71(35.0±17.0)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。将44例SLE和44例健康人纳入红细胞CD59分子水平与SLE的关联性研究，其中SLE组男4例、女40例，年龄16～60(35.4±11.8)岁；对照组男6例、女38例，年龄19～60(37.4±10.5)岁。2组性别及年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2观察指标 采集受试者清晨空腹静脉血2 ml至EDTA-K2抗凝管，混匀。采用美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪测定红细胞CD59分子水平，异硫氰酸荧光素标记鼠IgG2a κ和鼠抗人CD59单克隆抗体试剂购自美国BD Pharmingen公司，操作步骤按试剂盒说明书进行，测试结果采用相对几何平均荧光强度(rGMFI)表示，rGMFI=测试管GMFI/同型对照管GMFI。CD59基因标签SNP检测采用美国Beckman Coulter公司GenomeLabTMSNPstream®基因分型系统及SNPware杂交板及延伸反应、杂交反应试剂，方法参照文献[8]，SNP引物序列见表1。

表1 CD59基因单核苷酸多态性位点引物序列

2 结果

2.1红细胞CD59分子水平比较 SLE组红细胞CD59 rGMFI值为(63.661±18.773)低于对照组的(68.733±19.635)，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2基因型、等位基因频率及患病风险分析 经检验，2组7个SNP位点基因型和等位基因频率均符合HWE(P>0.05)。2组间rs11585和rs12576440基因型频率、等位基因频率比较差异有统计学意义(P<0.01)，SLE组rs11585 TT基因型及T等位基因、rs12576440 AG基因型及G等位基因频率高于对照组(P<0.01)，rs11585 CC基因型及C等位基因、rs12576440 AA基因型及A等位基因频率低于对照组(P<0.01)，其他5个SNP位点各基因型、等位基因组间频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 系统性红斑狼疮患者与健康人基因型、等位基因频率及患病风险分析

3 讨论

CD59作为补体调节蛋白，可以阻止自体细胞免受补体介导的破坏，发挥补体抑制剂作用。同时，它还参与免疫系统特异细胞受体信号传导，或作为其配体参与淋巴细胞和巨噬细胞的激活与增殖，在调节抗原递呈细胞和调节细胞因子、促炎分子中发挥重要作用[5]。故CD59分子及基因改变在免疫紊乱性疾病发生发展中可能具有非常重要的意义。

CD59广泛表达于循环细胞表面，在不同细胞系中表达差异很大，其中在红细胞中表达最高，而红细胞数量庞大，故CD59分子的免疫作用更值得重视[4-5]。一些研究证实SLE患者T、B淋巴细胞表面CD59分子水平显著降低[9-10]，且CD59水平与SLE疾病活动度有关[3]。本研究探究SLE患者红细胞CD59分子水平变化情况，结果显示SLE组红细胞CD59 rGMFI值低于对照组。

值得说明的是，虽然流式细胞术作为检测循环细胞表面分子的标准方法被广泛应用，但是检测数据分析多采用平均荧光强度(MFI)或GMFI。MFI仅适用于待测分子数量在细胞群中呈常数正态分布，而GMFI虽不受此限制，但受通道电压影响。rGMFI则通过反映比对同型对照样本的相对分子密度，间接反映单个细胞待测分子数量。本研究选择rGMFI分析红细胞CD59分子水平，既保证了因单个红细胞表面CD59分子数量不同致细胞群荧光强度不呈常数正态分布时能真实反映其数量水平，又克服了在细胞收集阶段通道电压对结果的影响，可以保证结果的可靠性和可比性。本研究SLE组红细胞CD59 rGMFI值低于对照组，这与理论推测结果一致，尽管2组间比较差异无统计学意义，但因单个红细胞CD59分子数量明显高于其他循环细胞，加之红细胞数量巨大，SLE患者红细胞CD59分子总数减少也十分可观。红细胞CD59分子数量降低会导致SLE患者体内过量的循环免疫复合物不能清除、大量趋化因子游离于组织间隙和血浆中及补体介导的红细胞溶解增多，致使循环免疫复合物沉积、炎性细胞增殖浸润及红细胞数量减少，而红细胞数量减少又加剧了免疫分子的下降，形成恶性循环，可能是SLE发生发展的重要原因之一。

SNP是指染色体上单个核苷酸变异而引起的DNA序列多态性。SLE是多基因遗传性疾病，越来越多的研究提示遗传因子可能影响SLE易感性，现已报道白细胞介素(IL)-1、IL-10、IL-19、IL-27、IL-35、IL-23R、CD40、Toll样受体7等多个免疫分子编码基因SNP与SLE发病有关[11-18]。

CD59作为重要的免疫分子，其编码基因多态性与免疫性疾病易感性的关联也受到关注。一项研究表明，CD59 rs861256 G等位基因与女性落叶型天疱疮易感性有关(OR=4.11，P<0.001)，且其携带者更易发展为全身性损害(OR=4.30，P=0.009)、更易于抵抗疾病缓解(OR=3.69，P=0.045)[19]。本研究则发现，CD59基因rs11585、rs12576440多态性与SLE易感性有关，rs11585 TT基因型及T等位基因、rs12576440 AG基因型及G等位基因是SLE发病的危险因子，rs11585 CC基因型及C等位基因、rs12576440 AA基因型及A等位基因是SLE发病的保护因子。在作用机制上，SNP可以调控mRNA的观点已被广泛接受[20]，不同区域的SNP作用模式有所不同。

rs11585、rs12576440分别位于3' -非翻译区和内含子。3' -非翻译区含有基因表达调控元件，这些元件和调控因子结合需要特定的序列组成，这些位点发生突变，可能导致与调控因子的结合能力发生改变，从而影响正常的基因表达。内含子区域SNP则主要依靠影响剪切位点活性来调控基因功能，剪切位点的失活可能会影响基因翻译功能，影响蛋白质序列。可见，SNP可能影响mRNA转录和蛋白质表达，最终在疾病进展中发挥作用。每个SNP位点可直接参与SLE进展或由与其连锁不平衡的易感性位点引起疾病，多个SNP位点对SLE易感性也可能产生协同效应[13]。

综上，本研究分析了SLE患者红细胞CD59分子水平的变化特点，发现CD59基因SNP位点rs11585、rs12576440与SLE发病有关，确定了易感基因型及等位基因，这些指标可作为SLE易感性筛查、早期诊断和病情监测的标志物，也为研究SLE发生发展机制和新治疗方法提供了线索。