酶抑制法在蔬菜质量安全控制中的应用

田 野

（湘潭市农产品质量安全检测管理站，湖南湘潭 411100）

蔬菜是与人们日常生活密不可分的常用农产品，蔬菜质量安全是政府和广大人民群众十分关注的一件事情，它不仅关系到广大人民群众的生命安全，而且关系到社会的稳定发展。蔬菜产品中农药残留已成为威胁百姓餐桌安全的“隐形杀手”，成为全社会关注的一个热点[1]。因此，加强蔬菜产品农药残留检测，有效防止不合格蔬菜进入市场，做好蔬菜产品“从农田到餐桌”的全程质量安全管控十分重要。

目前农药残留快速生化检测技术，主要有酶抑制法[2]和酶联免疫法[3]。酶联免疫法集测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一体，是检测某些重要痕量生物活性物质的好方法，但开发该种方法需要投入较多的资金和花费较长的时间，不利于广泛推广使用；酶抑制法是根据有机磷或氨基甲酸酯类农药的毒理特性，建立的一种快速检测农药残留的方法，是一种简便、灵敏、快捷、经济的检测方法。因此，该法得到了大力推广和使用，已经成为我国蔬菜农药残留快速检测的主流技术之一。

1 酶抑制法检测的基本原理和特点

1.1 酶抑制法的基本原理

有机磷和氨基甲酸酯类农药种类虽然繁多，但具有相同靶标作用的乙酰胆碱酯酶，都能抑制昆虫中枢和周围神经系统中的乙酰胆碱酯酶的活性。根据昆虫毒理学反应共性这一原理，在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶正常功能具有抑制作用，酶催化乙酰胆碱水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质。通过蔬菜样品提取液对乙酰胆碱酯酶抑制程度的测定，即可判断蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留是否超标[4]。在酶反应中加入显色剂和底物，观察溶液颜色的变化，采用分光光度计测定溶液体系的吸光度，即可判定乙酰胆碱酯酶受到抑制的程度，从而判定蔬菜中农药残留量的情况。即乙酰胆碱酯酶有机磷或氨基甲酸酯类农药和乙酰胆碱酯酶反应，则酶活性被抑制。

样本提取液和乙酰胆碱酯酶：如果样本提取液中含有有机磷或氨基甲酸酯类农药，则酶活性被抑制；如果样本提取液中不含有有机磷或氨基甲酸酯类农药，则酶活性正常[5]。有机磷农药与乙酰胆碱酯酶的反应可用下式表示：

EOH+AX→X-+H++EOA

1.2 酶抑制法的特点

酶抑制法是根据有机磷或氨基甲酸酯类农药的毒理特性，建立的一种快速检测农药残留的方法。该法检测时间短，整个检测过程最多20min左右，灵敏度较高，对操作人员的要求、成本消耗及后期维护的费用均较低，具有简便、快捷、灵敏、经济、检测人员易于掌握等特点。

2 酶抑制法检测蔬菜中农药残留的应用

2.1 检测范围

（1）蔬菜：叶果类、瓜果类、豆菜、根茎类、葱蒜类、茄果类等，其中小白菜、空心菜等极易存在农药残留。

（2）有机磷类农药：甲胺磷、对硫磷、敌敌畏等；氨基甲酸酯类农药：涕灭威、西维因、异索威、抗蚜威等[6]。

2.2 检测条件

室温保持在25～30℃，室内湿度不能高于85%[7]。

2.3 酶抑制法检测蔬菜中农药残留

2.3.1 主要仪器与试剂

WX-201型农药残留快速检测仪；台式恒温培养箱；微型样品混合器；电子天平；移液枪；Agilent 6890N型气相色谱仪，配有火焰光度检测器和自动进样器；N-EVAPI 12型旋转氮吹仪。

稀释液：用磷酸氢二钠、磷酸氢二钾和适量蒸馏水溶解。酶液：用乙酰胆碱酯酶配制。显色剂：二硫代双对硝基苯甲酸。底物试剂：碘化硫代丁酰胆碱。

2.3.2 检测方法

取一定量的蔬菜样品，切碎，混合均匀。称取2g蔬菜样品（非叶菜类称取4g），置于玻璃瓶中，加入缓冲液20mL，振荡3min后，倒出提取液，并静置3～5min。将小试管进行编号，用50μL移液枪移取酶液50μL，放入每个小试管中，在1号小试管中加入缓冲液3mL。在剩下的小试管中，用3mL移液枪移取样品提取液上清液3mL依次加入其中，再用50μL移液枪移取显色剂50μL依次加入小试管中，摇匀，置于38℃恒温培养箱内放置30min。将小试管取出，用50μL移液枪移取底物50μL依次加入小试管中，混匀后，分别倒入1cm比色皿中，立即放入仪器的样品器皿中，关闭样品池盖，按下仪器“开始样品分析”键，自动完成检测。对照测试，用1号小试管，其他步骤按照样品测试，得出空白试验。同时将蔬菜样品检测结果与气相色谱法进行验证[8]。

依据国家标准，抑制率≥70%，样品中残留有机磷或氨基甲酸酯类农药，表明样品不合格；抑制率＜70%，表明样品合格。蔬菜农药残留抑制率为-10%～110%，超出该范围则说明操作失误，必须重新检测[9]。

2.3.3 检测试验结果分析

对酶抑制法检测蔬菜中农药残留不合格的样品，采用气相色谱法进行验证试验。酶抑制法检测的不合格样品的检测结果与气相色谱法验证的检测结果如表1所示，农药浓度与抑制率关系的结果如表2所示。从表1可以看出，酶抑制法的检测结果与气相色谱法的检测结果符合率在90%以上。从表2可以看出，农药浓度与抑制率呈现正相关。

表1 酶抑制法检测结果和气相色谱法验证结果

表2 农药浓度与抑制率的关系

3 酶抑制法对蔬菜中农药残留检测存在的不足

3.1 检测农药种类的有限性

酶抑制法检测蔬菜中农药的残留，只有机磷农药和氨基甲酸酯类农药可以检测出，但有机氯类农药、菊酯类农药和杀虫双、噻螨酮、多杀菌素等其他类农药则无法检测出。酶抑制法对有机磷农药和氨基甲酸酯类农药虽然可以检测出，但不能准确判断超标农药的品种和超标量[10]。

3.2 误检现象的发生

（1）蔬菜样品色素的干扰对检测结果准确性的影响。待测蔬菜样品的色素如果含叶绿素、胡萝卜素等较高时，则会影响透过率，使测得的透过率较低，影响对吸光度随时间变化值的计算，使检测结果的准确性大大降低。

（2）出现假阳性和假阴性现象。假阳性是由于酶活性降低或失活，底物不与酶反应，从而不能被水解，无法与显色剂结合显色；假阴性是由于某些农药对酶抑制作用很小或无作用而产生的，表现出无农药残留的假象。另外在反应过程中，化学、物理干扰都可能导致假阳性、假阴性现象的发生。对蔬菜中农药残留检测出现的假阳性和假阴性现象，都会影响检测结果的准确性，出现误检现象[11]。

（3）空白值偏低。酶抑制法对蔬菜中农药残留的检测过程中，比色时记载的空白3min前后吸光值差值在0.3～0.8为好。如果酶活性不够，温度太低，空白吸光值差值可能会偏低，低于0.3。

3.3 实际操作中易出现误判现象

国内对于蔬菜农药残留的检测，蔬菜样品前处理环节比较简单，主要按照国家标准《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测》。实际操作时，蔬菜样品提取液只在缓冲液中经过简单的振荡、混匀、静置，没有经过净化和富集过程，干扰物质去除非常困难，因此，实际操作中容易出现误判现象。

4 检测过程中需注意的事项

1）检测试剂必须保存在0～5℃低温中，检测前必须恢复至常温，温度过高或过低，都会使酶的活性受影响。配好的检测试剂存放时间不宜过长，最长不超过30d。

2）静置时间过长或过短都会对检测结果有影响，因此，静置时间最佳为10min。

3）测定体系的pH对乙酰胆碱酯酶的活性影响很大，因此，测定体系的pH最佳为7.5～8.0。

4）酶显色最佳温度为37～38℃，温度低于37℃时，酶反应的速度减小，酶液和显色剂反应的时间需相对延长，反应时间得延长，需根据乙酰胆碱酯酶空白对照测试3min，吸光度变化△A0值在0.2～1.0，才可继续往下操作。应当特别注意，样品溶液的放置时间必须与空白对照溶液的放置时间保持一致[12]，否则会影响检测结果。

5 结论

1）对酶抑制法检测蔬菜中农药残留不合格的样品，采用气相色谱法进行验证试验，将酶抑制法的检测结果与气相色谱法验证的检测结果进行分析比较，结果表明，酶抑制法检测的结果与气相色谱法检测的结果符合率达到95%，农药浓度与抑制率呈现正相关。

2）酶抑制法对蔬菜中农药残留的检测很有效用，该技术是现阶段控制高毒性、高残留农药，防止不合格蔬菜进入市场的一种十分有效的检测方法，具有简便、快捷、灵敏、经济、检测人员易于掌握等特点，在整个农产品质量安全体系中发挥着重要作用，现已得到广泛普及。