引起浙贝母黑斑病的交链格孢单抗及检测试纸条的制备

温思思, 赵福运, 郭飘逸, 徐云飞, 赵伟春

(浙江中医药大学, 杭州 310053)

浙贝母FritillariathunbergiiMiq.是著名的“浙八味”之一,具有清热化痰,散结解毒的作用,可治疗风热咳嗽、肺痈喉痹、瘰疬、疮疡肿毒等症[1]。浙贝母黑斑病是由交链格孢Alternariaalternata等引起的真菌性病害[2],侵染的早期症状为叶尖发病,随后向叶基部蔓延,最后导致浙贝母鳞茎瘦小,产量及质量降低[3]。近年来,分子生物学[4-5]、光谱学[6]、红外热成像[7]等检测技术逐步应用于病害监测,但是上述检测手段技术复杂,成本高昂,不适于田间应用。农户依靠肉眼辨别症状,易误判且发现症状时通常已错过最佳防治时期。农户大多只能通过过量喷洒农药进行防治,不仅不能精准防治,还会造成病原微生物耐药性、农药残留、环境污染等问题。基于此,本项目采用杂交瘤技术制备针对交链格孢的单抗,并研发胶体碳免疫层析试纸条,为农户提供准确、高效、经济、便捷的浙贝母黑斑病检测产品,为田间浙贝母黑斑病的早发现、早防治提供技术支持,为研究浙贝母交链格孢的侵染机制提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种:从浙贝母黑斑病病株上分离并经分子鉴定的交链格孢菌株[2],本实验室保存。供试动物:Bal b/c小鼠,生产许可证:SYXK(浙)2021-0006,由浙江中医药大学动物实验中心提供。RPMI-1640干粉、HAT干粉、HT干粉、PEG-4000、降植烷均购自美国Sigma公司,辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG(酶标二抗)购自KPL公司,兔IgG、羊抗兔IgG、预染蛋白Marker均购自Solarbio公司,小鼠单抗亚类鉴定试剂盒购自佰奥通实验材料中心,胶体碳标记抗体试剂盒购自北京纳晶生物科技有限公司。

1.2 仪器

酶标仪Multiskan Flash购自Thermo公司,超声波细胞粉碎机BILON-250Y购自上海比郎仪器制造有限公司,电泳仪DYY-6C购自北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1抗原制备和小鼠免疫

挑取交链格孢单菌落接种于100 mL PDB培养基中,25℃振荡培养5 d后,收集菌丝和孢子,超声波破碎后6 000 r/min离心20 min,收集上清,酶标仪测定上清的蛋白含量,用pH7.2的PBS调节至蛋白浓度为1 mg/mL作为免疫抗原及后期检测用抗原。其他分离自浙贝母的真菌包括木贼镰刀菌Fusariumequiseti、灰葡萄孢Botrytiscinerea、半裸镰刀菌F.incarnatum、尖孢镰刀菌F.oxysporum、细极链格孢A.tenuissima、茄病镰刀菌F.solani、茎点霉属真菌Phomasp.和Phomopsisoblonga等抗原的制备方法同上。取交链格孢抗原免疫3只6～8周龄的Bal b/c小鼠[8],0.1 mg/只。第3次免疫后7 d,取小鼠颌下腺血,4℃冰箱放置15 min后,4 000 r/min离心10 min,取上层血清-20℃保存。采用间接ELISA测定血清效价[9]。用碳酸盐缓冲液将交链格孢抗原稀释1 000倍后包被酶标板(即1 μg/mL),4℃过夜,PBST洗涤3次后用3%脱脂奶封闭60 min。将小鼠血清倍比稀释加入包被孔,以1% BSA为阴性对照,每孔100 μL,37℃温育1 h,PBST洗涤3次后加入稀释5 000倍的酶标二抗100 μL/孔,37℃温育1 h,PBST洗涤后加入邻苯二胺(OPD)底物显色液显色,使用50 μL 2 mol/L的H2SO4终止反应后,酶标仪测定OD值(λ=490 nm),以与阴性对照比值大于2为阳性,最低阳性值对应的血清稀释倍数即为抗体的效价。

1.3.2单抗的制备

采用杂交瘤技术制备单抗[10]。取效价>104的小鼠制备脾细胞悬液,与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0在PEG-4000的作用下进行细胞融合。将融合细胞接种至96孔细胞培养板,用HAT培养基选择性培养13 d后,换用HT培养基继续培养。此时仍在生长的细胞即为杂交瘤细胞。待细胞铺满96孔板孔底1/4时,取细胞培养上清液,以稀释1 000倍的交链格孢抗原包被酶标板,采用间接ELISA检测各细胞培养孔中细胞分泌抗体的阳性反应情况。筛选出强阳性的细胞接种于24孔细胞培养板进行扩大培养。待细胞铺满24孔板孔底 1/4 时,取细胞培养上清液,以稀释1 000倍的木贼镰刀菌、茄病镰刀菌、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌、交链格孢、细极链格孢、灰葡萄孢、茎点霉属真菌和P.oblonga的抗原分别包被酶标板,用间接ELISA法检测抗体的特异性,筛选只与交链格孢反应的特异性细胞株,用有限稀释法进行克隆化培养[10];重复进行阳性孔筛选、扩大培养、特异性筛选和克隆化培养,直至获得阳性率为100%的单株细胞。进一步扩大培养,以细胞数5×105～1×106个/只注入预先腹腔注射降植烷的小鼠。收集腹水,纯化后 -80℃ 保存。

1.3.3单抗的特性鉴定

1.3.3.1单抗的效价检测

采用间接ELISA测定抗体的效价。操作流程见1.3.1,将小鼠血清替换为纯化后的腹水型单抗。

1.3.3.2单抗的特异性检测

以1.3.2所述的8种真菌为检测对象,将上述抗原用包被液稀释至1 μg/mL后包被酶标板。以1% BSA为阴性对照,用间接ELISA法检测腹水型单抗的特异性,其中单抗稀释20 000倍,酶标二抗稀释5 000倍。操作流程见1.3.1。

1.3.3.3单抗的灵敏度检测

采用间接ELISA测定单抗的灵敏度。步骤同1.3.1,将抗原倍比稀释(1∶80×20～1∶80×210)后包被在酶标板上,重复8次,第12列为阴性对照,用1% BSA包被。以稀释20 000倍的单抗作为一抗,与阴性对照比值大于2则视为阳性,测得抗原最大稀释倍数,检测灵敏度=1 000 μg/mL÷最大稀释倍数。

1.3.3.4单抗的类型及亚类鉴定

用鉴定小鼠单抗亚类的ELISA试剂盒对单抗类型和亚类进行鉴定。单抗稀释20 000倍用于检测,每种单抗重复3次,其他操作步骤按试剂盒说明书进行。阳性孔所对应的抗体Ig类型及亚类即为该单抗的抗体类型及亚类。

1.3.3.5抗体结合蛋白的检测

采用Western blot技术检测抗体结合蛋白。浓缩胶和分离胶的浓度分别为5%和10%,样品和预染的Marker的上样量分别为20 μL和3 μL。经10 mA 恒流后改为120 V恒压。半干转印法在25 V恒压下转印30 min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。转印后的膜用3%脱脂奶室温封闭,单抗稀释20 000倍,酶标二抗稀释5 000倍,二氨基联苯胺(DAB)显色液显色,蒸馏水终止显色反应。以标准蛋白(M)的对数对相对迁移率(x)拟合线性方程。根据待测蛋白质样品的相对迁移率,计算其相对分子质量:log(M)=alogx+b。

1.3.4胶体碳免疫层析试纸条的制备及初步应用

试纸条的制备:取稀释10倍后的腹水型单抗AaA1和兔IgG抗体,按照胶体碳标记抗体试剂盒说明书分别制备碳标抗体。将15 μL碳标单抗AaA1、25 μL碳标兔IgG抗体与25 μL喷碳稀释液混合后按4 μL/cm喷点在玻璃纤维膜上,37℃烘干。在NC膜上,喷涂45 μL羊抗兔IgG作为质控线,喷涂45 μL单抗AaC2作为检测线,37℃干燥过夜。将样品垫、喷有碳标抗体的玻璃纤维膜、包被有羊抗兔IgG和单抗AaC2的NC膜、吸水纸按序粘于双面胶板上,完成后切割成3 mm的试纸条,组装至包装盒内成胶体碳免疫层析试纸条[11]。

试纸条的初步应用:取1 000 μg/mL的交链格孢抗原,用PBS缓冲液倍比稀释(1∶10×21～1∶10×26),吸取100 μL滴加于试纸条加样孔中。以滴加相同体积的PBS缓冲液为空白对照。10 min内观察检测线和质控线的颜色变化。试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 杂交瘤细胞株的制备

共获得杂交瘤细胞生长孔189个,融合率为33.1%,其中阳性孔26个,阳性率为13.7%。最终得到3株稳定分泌针对交链格孢抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为AaA1、AaC2和AaC5。各细胞株分别制备获得腹水型单抗约10 mL。

2.2 单抗的效价测定

如图1所示,AaA1的效价为稀释6.40×105倍,AaC2、AaC5的效价均为稀释1.28×106倍,稀释20 000倍时OD值明显降低,选择稀释20 000倍用于后续试验。

图1 交链格孢单抗效价Fig.1 Titer of monoclonal antibody (McAbs) against Alternaria alternata

2.3 单抗的特异性检测

单抗AaA1、AaC2、AaC5均只与交链格孢抗原反应,均不与木贼镰刀菌、灰葡萄孢、半裸镰刀菌、细极链格孢、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、茎点霉属真菌、P.oblonga的抗原反应。结果见图2。

图2 交链格孢单抗的特异性检测Fig.2 Specific detection of McAbs against Alternaria alternata

2.4 单抗的灵敏度测定

如图3所示,AaA1的抗原最大稀释倍数为81 920倍,即检测灵敏度为:1 000 μg/mL÷81 920=12.21 ng/mL。AaC2、AaC5的抗原最大稀释倍数均为40 960倍,即检测灵敏度为:24.41 ng/mL。

图3 交链格孢单抗灵敏度Fig.3 Sensitivity of McAbs against Alternaria alternata

2.5 单抗类型及亚类测定

当单抗与某种已知类型或亚型的酶标第二抗体特异性结合时,则该单抗即为对应的抗体Ig类型及亚类。如图4所示,AaC2、AaC5抗体类型均为IgG3,AaA1则为IgG2a。

2.6 单抗结合蛋白检测

如图5和表1所示,以标准蛋白质M的对数对相对迁移率x拟合方程,计算得出AaA1、AaC2、AaC5的结合蛋白分子量分别为37、62 kDa和66 kDa。

图4 交链格孢单抗类型与亚类Fig.4 Antibody type of McAbs against Alternaria alternata

表1 单抗结合蛋白标准曲线及分子量

2.7 胶体碳免疫层析试纸条的制备及初步应用

随着抗原浓度升高,检测线从无到有,由浅入深,抗原最低检测浓度为6.25 μg/mL(图6)。由于检测时加样量为100 μL,抗原最低检测量为625 ng。

图5 交链格孢单抗结合蛋白Fig.5 Alternaria alternata McAbs binding protein

图6 胶体碳免疫层析试纸条的初步应用Fig.6 Preliminary application of colloidal carbon immunochromatographic test strips

3 结论与讨论

植物感染真菌性病害是一个病原真菌在体内不断累积的过程。当病原真菌侵染至一定程度时会表现出病害症状,此时植物体内的病原真菌数已达到较高的水平,施用杀菌剂的防治效果不尽如人意,亟须一种快捷简便的早期诊断技术。近年来,植物病害检测技术发展迅速,赵森等[6]利用高光谱技术,已实现刺五加黑斑病的早期诊断,能够保证较高的准确性和实时性,但光谱技术目前仅适用于科学研究;向日葵黑斑病的检测方式主要集中于PCR检测技术[12],不适用农户田间应用;月季[13]、冬枣[14]、菊花[15]、浙贝母[2]等植物黑斑病检测方式集中于形态学和分子生物学方法,分子生物学检测方法虽然精准度高,但是需要较高成本,缺乏实用性[7]。因此,为准确且及时地确定病害种类,需要更为精准且实用的检测手段。制备针对基于单抗的浙贝母黑斑病胶体碳免疫层析试纸条将为诊断黑斑病提供新的便捷手段。

不同于常规单抗制备过程中采用单一特异性目的蛋白作为免疫原[17-18],本文以交链格孢的孢子和菌丝经超声波破碎后溶解于PBS的上清蛋白为抗原免疫小鼠,全菌体蛋白成分复杂,不同真菌间存在相似抗原成分,尤其是同属的不同种间,能与抗体发生相似的分子识别作用,使得相互间可能发生交叉反应。为此,本文通过对抗体进行大规模的特异性筛选,得到了不与其他8种分离自浙贝母的其他属的病原真菌交叉反应,只针对交链格孢的单抗及其细胞株。经检测,单抗灵敏度高,且不受浙贝母提取液干扰;特异性强,能够与交链格孢抗原强烈反应而不与其他菌种交叉反应并且与目标蛋白结合单一;灵敏度高,与目标蛋白结合的分子量大小固定,具有良好的开发前景。

基于此单抗的免疫层析试纸条抗原最低检测限位为6.25 μg/mL,采用的胶体碳颗粒具备更高的灵敏度、稳定性和环保性[16],更符合田间检测条件和需求。田间应用时操作简便,只需要利用配备的一次性离心管、研磨棒、吸管等进行简单的研磨和加样就可完成全部操作,并且不需要复杂的仪器设备。检测时间从采样到出结果只需15 min,特别适用于田间样品的大规模快速检测。此外,1株单抗的开发成本约为3.5万元,相较于杂交瘤细胞株的制备,后续单抗及试纸条的制备所需成本更为低廉。并且试纸条的大量生产使得制备杂交瘤细胞株所需的费用分摊至单个试纸条的费用降低,生产成本仅为1.7元/条。同时出于试纸条运输、储存、推广等额外费用及盈利的考虑,试纸条定价5元/条。与其他检测方法相比较,成本非常低,基层人员普遍可以承受。目前试纸条仍处于实验室应用阶段,后期将逐步开展该试纸条的田间检测应用。

由交链格孢引起的黑斑病危害农作物的种类众多[19-20],制备针对交链格孢的单抗及其检测试纸条不但可为浙贝母黑斑病的田间快速、简便、经济的检测提供手段和方法,也可能为其他植物黑斑病的快速检测提供科学依据,为植物黑斑病的早发现、早防治提供可能。