新疆伊犁州小麦条锈菌生理小种鉴定及毒性分析

刘 琦, 陈 利, 曾明昊, 艾尼赛·赛米, 马泽宇, 马占鸿

(1. 新疆农业大学农学院, 农林有害生物监测与安全防控重点实验室, 乌鲁木齐 830052;2. 中国农业大学植物保护学院植物病理学系, 北京 100193)

由条形柄锈菌小麦专化型Pucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst)引起的小麦条锈病是对我国小麦危害最重的气传性真菌病害,也是新疆麦区重要病害之一[1-3]。该病害具有发生范围广、危害程度重、大区流行等特点。病原菌营活体专性寄生,喜冷凉,其无性孢子可高空远距离传播[4]。近些年来,小麦条锈菌新的生理小种不断出现,我国小麦品种抗病性渐渐丧失[5]。目前,防治小麦条锈病较为经济有效的措施是选育和推广抗病品种[6-7]。小麦条锈菌生理小种具有高度变异特性,是造成病害流行的主要因素,使得小麦品种的抗病性较易被新毒性小种所克服而在3～5年内因抗性丧失而失去利用价值[8]。20世纪50年代以来,我国有7～8次大规模小麦品种更替,均是由于小麦品种对条锈菌生理小种的抗病性丧失导致[9]。已有研究认为,条锈菌在伊犁河谷地区海拔669 m可以顺利越夏、越冬,完成周年循环,形成一个相对独立的流行区系[10]。

近年来,新疆维吾尔自治区伊犁州小麦条锈病发生危害日趋严重,本研究通过广泛采集伊犁州小麦条锈病样品,采用我国通用鉴别寄主对其进行生理小种鉴定和毒性分析,以期能够掌握伊犁州小麦条锈菌毒性组成,为指导新疆小麦抗病育种、品种合理布局提供重要科学依据。

1 材料与方法

1.1 小麦条锈菌样品的采集

2020年5月采集新疆伊犁州小麦条锈菌样品149份(表1)。采集初始发病样品(即锈孢子堆新鲜饱满,病斑清晰的叶片),单独平放于采样袋内,记录样本详细信息(采集地点、经纬度、海拔高度等),置于实验室4℃干燥器中冷藏备用。

表1 2020年小麦条锈菌样品采集信息

1.2 小麦条锈菌样品纯化与扩繁

1.2.1小麦种植

小麦条锈菌的分离、扩繁与鉴定均在新疆农业大学农学院人工气候室进行。于接种前10～15 d种植感病小麦品种‘铭贤169’。挑选粒大饱满的种子,均匀播种于装有营养土的小花盆(d=10 cm)中,每盆约播15粒,置于(11.8±3)℃人工气候室培养备用。

1.2.2菌种活化

于接种前一天,用流水冲洗掉病叶表面的尘土杂质,叶片正面向上平整地铺放于铺有湿润滤纸的直径10 cm的培养皿底部,盖上培养皿盖,于4℃黑暗条件下保湿8～12 h。待产生鲜黄色夏孢子时,即可用于接种。

1.2.3接种

当小麦第1叶完全展开时接种小麦条锈菌。去除叶片表面蜡质后,喷施0.01%吐温80水溶液,然后挑取单个夏孢子堆转移至小麦叶片表面的液滴上。接种完成后将花盆置于泡沫箱(相对湿度为80%)中黑暗保湿24～36 h,温度为(11.8±3)℃。随后转移至人工气候室内罩上玻璃罩继续培养,培养条件为(11.8±3)℃、L∥D=12 h∥12h,光照强度为 8 000～10 000 lx,约10 d左右叶片出现潜育斑。

1.2.4菌种扩繁

接种后15～20 d,叶片表面逐渐产生夏孢子堆后进行菌种收集及扩繁。用玻璃棒轻敲小麦叶片,将夏孢子收集至离心管中,存于4℃干燥器中冷藏备用。重复接种3～5次直至扩繁到10～15 mg足够用于生理小种鉴定的夏孢子量。

1.3 小麦条锈菌生理小种鉴定

1.3.1小麦条锈菌鉴别寄主

以感病品种‘铭贤169’作为对照,采用中国通用的19个小麦条锈菌鉴别寄主品种对本研究采集的小麦条锈菌生理小种进行鉴定。鉴别寄主及其所含抗性基因如表2所示。

表2 鉴别寄主及其所携带的抗条锈基因

1.3.2生理小种鉴定

待鉴别寄主麦苗长至1叶1心期用10 mL喷瓶喷雾接菌。与扩繁接种方法相同,将纯化扩繁的菌种接种于鉴别寄主小麦叶片上,待指示品种‘铭贤169’充分发病后,逐叶调查并记载每个分离物在各个鉴别寄主上的侵染型。侵染型分级按 0、0;、1、2、3、4共6级标准(表3)进行划分,其中0～2级为抗病(R),3～4级为感病(S)。根据侵染型类型判定条锈菌生理小种类型[11]。

1.4 数据处理

毒性分析采用二元归类法,即抗病型(0～2级)记作“0”,感病型(3～4级)记作“1”,每个寄主品种作为一个毒性位点,基于简单的相似矩阵,利用Popgen 1.32软件计算毒性多态性位点数、多态性位点百分率、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数、Shannon信息指数、Nei’s遗传距离,Nei’s遗传分化指数。根据Nei’s遗传距离,用NTsys 2.10e软件对条锈菌群体进行聚类分析[12]。

表3 小麦条锈病菌苗期侵染型分级标准

2 结果与分析

2.1 149个小麦条锈菌样品的生理小种鉴定结果

149份样品可明确归类为28个生理小种类型,并将其分为以下几个小种类群,其中毒性谱较窄的古老小种有CYR 17、CYR 18、CYR 24和CYR 26;洛10类群的小种有CYR 28和洛10-2;洛13类群的生理小种有CYR 29、洛13-2和洛13-3;Hybrid 46类群的生理小种有CYR 30、CYR 31、CYR 32、Hy-4、Hy-7和Hy-8;水源11类群的生理小种有Su 11-1、Su 11-2、Su 11-4、Su 11-7、Su 11-8、Su 11-9、Su 11-10、Su 11-12、Su 11-13和CYR 33;贵农22类群的生理小种有CYR 34、贵22-13和贵22-14(表4)。

表4 2020年伊犁州小麦条锈菌生理小种鉴定结果

2.2 致病类群分析

2020年新疆伊犁州监测到CYR 17、CYR 18、CYR 24、CYR 26生理小种共15份,占比10.07%;洛10类群11份,占比7.38%;洛13类群9份,占比6.04%;Hybrid 46类群27份,占比18.12%;水源11类群66份,占比44.30%;贵农22类群21份,占比14.09%(表4)。

监测结果表明,水源11类群、Hybrid 46类群和贵农22类群是危害新疆伊犁州小麦生产的主要致病类群,3个类群出现频率为76.51%。水源11类群出现频率最高,出现频率高达44.30%,为伊犁州的优势致病类群。

2.3 小种类型分析

在Hybrid 46类群中,CYR 32小种出现频率最高,为8.05%,是本类群中的优势小种; 而CYR 30和CYR 31出现频率均为4.03%,呈现低频发生,不再具备流行优势。

水源11类群中,CYR 33小种出现频率为14.09%,为2020年监测到的该类群中及伊犁州所有类群中出现频率最高的生理小种。且CYR 33小种分布范围广,在所监测的7个县(乡)中均被检出,由此判定CYR 33为新疆伊犁州小麦条锈菌优势生理小种。其次是Su11-1和Su11-12,出现频率为12.75%和8.05%,Su11-2、Su11-4、Su11-7、Su11-8、Su11-9、Su11-10、Su11-13出现频率在0.67%～2.68%。

贵农22类群中,CYR 34(贵农22-9)小种出现频率为7.38%,已上升为该类群中的优势小种,也是目前公认致病力最强的生理小种,在19个鉴别寄主中,只对‘中四’和‘T.speltaalbum’无毒力,是值得关注和警惕的生理小种。

2.4 毒性频率分析

由毒性频率分析结果(表5)可知,149个条锈菌样品对20种抗条锈基因均具有毒性,毒性频率为14.09%～87.25%,表明该地区条锈菌群体的毒性基因类型多样。小麦条锈菌在携带抗条锈基因Yr1、YrA、Yr3、Yr6、YrSu、Yr9的载体品种上的毒性频率为87.25%、86.58%、83.89%、83.89%、72.48%、73.15%,均大于70%,表明这些抗性基因在伊犁州基本失效;而在携带抗条锈基因YrVir1、YrVir2、YrVir3、YrVir4(‘维尔’)，YrJu1、YrJu2、YrJu3、YrJu4(‘尤皮Ⅱ’)，YrKy1、YrKy2、YrKy、YrKy4(‘抗引655’)，Yr3b、Yr4b(‘Hybirid 46’)，Yr10、Yr24、Yr26(‘贵农22’)载体品种上的毒性频率为51.68%、41.61%、40.94%、30.20%、14.09%,是抗病育种时值得关注的抗性基因。

表5 149个小麦条锈菌样品的毒性基因及毒性频率

2.5 小麦条锈菌毒性多样性分析

2.5.1小麦条锈菌毒性多样性

对伊犁州2020年小麦条锈菌群体毒性多样性参数进行统计分析发现(表6),在物种水平上,多态性位点数为17个,多态性位点占比89.47%;Nei’s 遗传多样性指数为0.34;Shannon 信息指数为 0.50;表明整体多态性水平较高。在群体水平上,等位基因数为1.79～1.89;有效等位基因数分布于 1.57～1.64;Nei’s 遗传多样性指数为 0.32～0.34,平均 0.33;Shannon 信息指数为 0.47～0.49,平均0.48;多态性位点数为 15～17,平均为 16;多态性位点占比 78.95%～89.47%,平均 84.21%。由Nei’s遗传多样性指数和Shannon信息指数可知,伊犁州4县条锈菌毒性多样性水平差异不显著。

表6 2020年伊犁州小麦条锈菌群体毒性多样性指数1)

2.5.2小麦条锈菌不同群体间遗传相似性分析

由表7可知,2020年伊宁县和巩留县小麦条锈菌的Nei’s遗传一致度(GI=0.992 5)及遗传距离(GD=0.007 5)最近。在群体水平上,2020年伊犁州小麦条锈菌的遗传距离为0.007 5～0.078 9(<0.10),Nei’s 遗传一致度为0.924 1～0.992 5(>0.90),表明4县小麦条锈菌间的遗传距离较近,群体毒性结构相似。

表7 2020年伊犁州小麦条锈菌4个群体间遗传距离和Nei’s遗传一致度1)

对伊犁州不同小麦条锈菌群体毒性相似性进行聚类分析发现(图1),2020年4个小麦条锈菌群体的毒性相似系数在0.92～1.00,说明整体毒性相似系数较高,毒性多态性不显著,遗传距离较近,毒性结构相似。当种群之间相似系数阈值为0.99时,伊宁和巩留群体聚为一类,其毒性相似程度最高;在相似系数阈值为0.96时,察布查尔群体与其他群体聚在不同分支,表明其与其他各县条锈菌毒性相似程度最低。

图1 2020年伊犁州小麦条锈菌群体毒性聚类分析树状图Fig.1 Virulence dendrogram of the Puccinia striiformis f.sp. tritici population in Yili prefecture in 2020

3 结论与讨论

小麦条锈菌生理小种毒性变异是导致小麦品种抗锈性丧失的主要原因[12-13]。了解小麦条锈菌群体毒性结构,监测生理小种毒性变异是预测小麦条锈病发生流行、小麦品种抗条锈寿命及抗病育种的重要前提,能为小麦条锈病的有效防治提供理论依据。王付平[14]的研究表明,新疆条锈菌群体遗传多样性丰富,不同地域群体不存在遗传分化,相似度较高。在新疆没有监测到贵农22类群的生理小种。李伟华等[15]的研究表明,伊犁河谷地区小麦条锈菌主要致病类群为Hybrid 46类群、水源11类群、贵农22类群,出现频率分别为31.25%、22.92%和18.75%,但其样品均采自新源县,具有地缘局限性。贾秋珍等[16]2017年至2018年对采自甘肃省不同生态区的572份小麦条锈菌样品进行生理小种鉴定及监测,发现主要致病类群为贵农22类群,主要流行小种为CYR 34生理小种,且出现频率稳定;而本研究结果显示,在新疆,贵农22类群出现频率为14.09%,CYR 34生理小种出现频率为7.38%,这两个类群(小种)在新疆虽不占主导地位,但出现频率逐步提升,表明相对于甘肃而言,新疆小麦条锈菌毒性变异速率较慢,可能与新疆推广的小麦品种抗性或者新疆条锈菌有性生殖阶段的作用或者地理隔离及气候因素有关,需要进一步深入分析。

本研究采集的小麦条锈菌样品分布于伊犁州4县7地,主要致病类群为水源11类群、Hybrid 46类群和贵农22类群,出现频率分别为44.30%、18.12%和14.09%。伊犁州小麦条锈菌毒性多态性较为丰富,在物种水平上多态性位点达17个,多态性位点百分率达89.47%;Nei’s遗传多样性指数及Shannon信息指数说明伊犁州小麦条锈菌群体毒性多样性水平较高,群体间毒性相似系数较高。

各群体间的地理距离与其毒性多态性并无显著相关性。例如,伊宁县与巩留县相距较远,但是聚类图显示两地小麦条锈菌的毒性结构相同;伊宁县与察布查尔县地理位置相邻,但二者毒性结构并不相似。可能受采集样本量及样点的地理环境、小麦品种布局、种植面积的影响,也可能受到小麦条锈菌自身的寄生适合度的影响。本研究只针对伊犁州部分县市的小麦条锈菌生理小种进行了详细鉴定,采样范围仍相对局限,在以后的研究中应扩大取样范围并形成持续动态的监测。