基于病证结合的中药复方治疗糖尿病机制

尚津锋 李倩楠 刘 欣 崔一然

在全球范围内，糖尿病患病率和发病率急剧攀升[1-2]。国际糖尿病联盟2017年数据显示，全球糖尿病成人患者约4.25亿，预计到2045年，可能达到6.29亿。由此可见，控制和治疗糖尿病刻不容缓。糖尿病，是以高血糖为主要特征的代谢紊乱性疾病，多由不良生活方式如营养过剩、缺乏运动导致。糖尿病患者多表现为多饮、多尿、多食、消瘦、乏力症状，久之全身多器官多系统受损[3]。中医治病运用“辨证论治”的思路，以中医证候为依据指导临床合理用药，达到“病证结合”的目的[4]，中药复方在预防和治疗糖尿病方面已表现出良好疗效，但中药复方治疗不同证候疾病的生物学机制难以明确。近年来，分子生物学在中医药领域中广泛使用，这有利于从分子水平上探讨和研究中医药治疗疾病的作用机制[5]。中医药整合药理学研究平台，一个以大数据为基础的智能化数据挖掘平台，具备建立宏观病证与微观分子之间关联的能力，能够解决病证结合作用机制研究不明的难题[6]。

本研究通过中药整合药理学网络结合文献查找，在构建方-多靶点-多通路和证-多靶点-多通路的基础上，筛选出方与病证结合的靶点并进行通路分析，从而探讨中药复方治疗糖尿病不同证候机制，以期为中药治疗糖尿病提供实验依据和参考。

1 资料与方法

1.1 糖尿病治疗方剂及对应证候来源

根据临床疗效，小陷胸汤[7-8]、消渴丸[9-10]、玉泉丸[11-12]、杞菊地黄丸[13-14]4个中药复方在治疗糖尿病方面均取得较好的临床疗效。按照“十二五”普通高等教育本科国家级规划教材、国家卫生健康委员会“十三五”规划教材、全国高等中医药教材《中医内科学》[15]，查找小陷胸汤、消渴丸、玉泉丸、杞菊地黄丸4个方剂对应的中医临床表现，运用“病证结合”的思想，将4种症状表型归纳为痰热互结、肺热津伤、气阴两虚、肝肾阴虚4个证候。相关临床表现与中医药整合药理学平台V2.0（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine V2.0, TCMIP V2.0,http://www.tcmip.cn/）中表型英文词条相匹配。见表1。

表1 糖尿病证候、临床表现和治疗方剂

1.2 糖尿病、证候、方剂靶标获取

TCMIP V2.0集合HPO、OMIM、TTD、Drugbank等数据库，在该平台对糖尿病不同证候临床表现的相关英文词条进行检索，从而获得证候靶标群[16]。运用TCMIP V2.0检索小陷胸汤、消渴丸、玉泉丸、杞菊地黄丸组成中药的靶标以及糖尿病、痰热互结证、肺热津伤证、气阴两虚证、肝肾阴虚证获得相关靶点。获取的病证和方剂靶标由MedChem Studio预测，只保留可靠性分值大于0.8的靶标[17]。

1.3 核心靶标筛选、富集分析和网络构建

TCMIP V2.0镶嵌HAPPI等数据库，通过该平台的中医药关联网络挖掘功能模块获得核心靶标，流程如下：以连接度（Degree）、介度（Betweenness）和紧密度（Closeness）的中位数为卡值，筛选核心节点网络中的关键节点基因[17]。运用TCMIP V2.0筛选中药与证候、疾病的核心靶标，并利用DAVID软件（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）对核心靶标进行基因本体（GO）富集分析和京都基因以及基因组百科全书（KEGG）富集分析。根据P值筛选出排名前20的信号通路进行分析。“中药-靶标-通路-证候-疾病”关联网络图通过Cytoscape3.8.0软件进行可视化。

2 结果

2.1 痰热互结证糖尿病的分子基础及对应方剂的作用机制

痰热互结证候有439个靶标。针对此证候，可选用小陷胸汤进行治疗。小陷胸汤有514个作用靶标。糖尿病有167个靶点，从而获得小陷胸汤治疗痰热互结证糖尿病的140个核心靶点。小陷胸汤治疗痰热互结证糖尿病主要涉及cAMP signaling pathway，Insulin resistance，Insulin signaling pathway，Prostate cancer，Hepatitis B，Pathways in cancer，FoxO signaling pathway，Insulin secretion，Adipocytokine signaling pathway，Neurotrophin signaling pathway，mTOR signaling pathway，AMPK signaling pathway，Pancreatic cancer，Glucagon signaling pathway，HTLV-I infection，Regulation of lipolysis in adipocytes，cGMP-PKG signaling pathway，Estrogen signaling pathway，Prolactin signaling pathway，TNF signaling pathway等通路。169个节点、540条边的“中药-靶标-通路-证候-疾病”网络见图1。

图1 小陷胸汤治疗痰热互结证糖尿病的核心靶点和通路

2.2 肺热津伤证糖尿病的分子基础及对应方剂的作用机制

肺热津伤证候有326个靶点。玉米须在TCMIP V2.0中无法检索，故删去。检索除玉米须外的其他药物（包括格列苯脲）获得消渴丸561个靶标，进而得到161个核心靶点。GO富集和KEGG富集结果显示，消渴丸治疗肺热津伤证糖尿病主要涉及Hepatitis B，Measles，HTLV-I infection，Pathways in cancer，Prostate cancer，cAMP signaling pathway，Chronic myeloid leukemia，Pancreatic cancer，FoxO signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，Prolactin signaling pathway，Apoptosis，Jak-STAT signaling pathway，Toxoplasmosis，Dopaminergic synapse，Glioma，Osteoclast differentiation，Amphetamine addiction，Thyroid hormone signaling pathway等通路。186个节点、771条边的“中药-靶标-通路-证候-疾病”网络见图2。

图2 消渴丸治疗肺热津伤证糖尿病的核心靶点和通路

2.3 气阴两虚证糖尿病的分子基础及对应方剂的作用机制

检索得到气阴两虚证候323个靶点。玉泉丸有529个作用靶标。检索到167个糖尿病靶点，筛选到INS、AVPR2、PIK3CA、PIK3R1等162个核心靶点。对162个核心靶标的GO富集和KEGG富集分析发现，玉泉丸对气阴两虚证糖尿病的治疗主要涉及Pathways in cancer，Hepatitis B，Prostate cancer，cAMP signaling pathway，Measles，Colorectal cancer，PI3K-Akt signaling pathway，Amphetamine addiction，Circadian entrainment，Thyroid hormone signaling pathway，Prolactin signaling pathway，Proteoglycans in cancer，Apoptosis，Central carbon metabolism in cancer，FoxO signaling pathway，Estrogen signaling pathway，mTOR signaling pathway，AMPK signaling pathway等通路。182个节点、661条边的“中药-靶标-通路-证候-疾病”网络见图3。

图3 玉泉丸治疗气阴两虚证糖尿病的核心靶点和通路

2.4 肝肾阴虚证糖尿病的分子基础及对应方剂的作用机制

检索到625个肝肾亏虚证候靶点。针对此证候，杞菊地黄丸潜在作用靶点有807个。TCMIP V2.0筛选到226个核心靶点。对226个核心靶标进行GO富集和KEGG富集分析发现，杞菊地黄丸治疗肝肾阴虚证糖尿病主要涉及的通路包括Pathways in cancer，Prostate cancer，Hepatitis B，Colorectal cancer，Chronic myeloid leukemia，cAMP signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，Pancreatic cancer，Glioma，Prolactin signaling pathway，FoxO signaling pathway，Central carbon metabolism in cancer，Cholinergic synapse，Estrogen signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，Melanoma，Endometrial cancer，Rap1 signaling pathway，Acute myeloid leukemia等。256个节点、927条边的“中药-靶标-通路-证候-疾病”网络见图4。

图4 杞菊地黄丸治疗肝肾阴虚证糖尿病的核心靶点和通路

3 讨论

随着人民生活水平的提高，糖尿病逐渐成为普遍性疾病。目前，中医药在糖尿病治疗方面发挥显著作用。为此，本研究以小陷胸汤等4个方剂为切入点，基于TCMIP V2.0展开“4个方剂，4种证候”的分子生物学研究，从生物信息学角度，揭示中医药治疗糖尿病的潜在机制，为诠释传统中医药理论的科学内涵提供依据。中国中医药学会糖尿病学会消渴病专业委员会曾提出分期辨证糖尿病的观点，将糖尿病分为5期：隐匿期，消渴期，并发症早、中、晚期[18]。糖尿病隐匿期，以阴虚为主要病机，多出现形体肥胖、舌红脉数等症状。在消渴期，肺热津伤、胃热炽盛等阴虚化热的证候表现出来，患者通常出现“三多一少”、舌红苔薄等症状。处于并发症期的患者脏腑开始不同程度损伤。从病机上看，并发症早期气阴两伤，中期痰瘀互结，晚期气血阴阳俱衰。吕仁和教授[19]曾将糖尿病分为3个时期：脾瘅、消渴、消瘅期。最近，仝小林院士[20]提出“分类—分期—分证”思想、“态靶结合”思想，为糖尿病的治疗开拓了新的道路。由此可见糖尿病的分期分证治疗得到许多医家认可。早期，痰热互结，使用小陷胸汤理气化痰。随着疾病传变，患者出现糖尿病经典“三多一少”症状，接近中医所讲的“消渴病”，消渴丸可作为主要复方进行治疗。中后期，患者开始出现多种并发症，肺、肝、肾等脏器出现异常，表现出气阴两虚和肝肾阴虚的证候，使用玉泉丸和杞菊地黄丸对症治疗。总之，糖尿病以痰、热、燥、瘀4种病机贯穿始末[21]，不同发病阶段表现出不同症状，通过辨证论治，针对糖尿病的早期、中期、后期、末期4个阶段推荐方剂小陷胸汤、消渴丸、玉泉丸、杞菊地黄丸。

GO富集和KEGG富集结果显示，小陷胸汤、消渴丸等4个复方治疗糖尿病均涉及的通路有7个，分别为 cAMP signaling pathway，FoxO signaling pathway，Pathways in cancer，Prostate cancer，Hepatitis B，Prolactin signaling pathway以及HTLV-I infection。cAMP signaling pathway通过改变腺苷酸环化酶活性调节靶细胞内第二信使cAMP水平，cAMP水平改变可能与糖尿病病程中视网膜代谢紊乱以及肾脏纤维化相关[22-23]；FoxO是一类重要的转录因子，抑制该类物质的活性可降低患糖尿病风险，如FoxO1促进葡萄糖-6-磷酸酶等表达导致胰岛素耐受，损伤胰岛B细胞[24-25]；糖尿病与癌症关系密切[26]，Pathways in cancer等癌症通路可能是糖尿病导致肿瘤的机制之一；Hepatitis B通路与糖尿病关系已被验证，可能机制是乙肝病毒通过损伤肝功能而导致肝脏糖代谢异常并产生胰岛素抵抗[27]；实验表明催乳素体外条件下可抑制高糖诱导的胰岛β细胞凋亡，但机制颇有争议[28]；HTLV-I infection通路的出现提示人类嗜T细胞病毒可能与糖尿病相关。由此说明，提高机体营养物质代谢和能量转换、抑制癌症细胞和炎症因子是治疗不同证候糖尿病的基本思路。

小陷胸汤治疗痰热互结型糖尿病的分子通路主要为cAMP signaling pathway,Insulin resistance,Insulin signaling pathway等，作用机制涉及：1）通过胰岛素、胰高血糖素、甲状腺激素等调节血糖水平，并且促进脂肪代谢，相关通路包括Insulin resistance，Insulin secretion，Insulin signaling pathway，FoxO signaling pathway，Glucagon signaling pathway，Regulation of lipolysis in adipocytes等，从而达到降低血糖、减少脂肪堆积的功效，此外，小陷胸汤可能通过AMPK signaling pathway通路促进糖脂分解代谢并减少合成代谢[29]，改善胰岛素抵抗。2）提高机体营养物质吸收代谢和能量代谢，兼缓解机体神经系统异常，相关通路包括cAMP signaling pathway，cGMP-PKG signaling pathway，neurotrophin signaling pathway等，这些通路主要对倦怠、脘痞等症状有调节作用。3）调节阴阳，扶正祛邪，小陷胸汤可能通过抑制过度免疫反应，纠正失衡的炎症，抑制相关的癌症，通路有Hepatitis B，TNF signaling pathway，Prostate cancer，Pathways in cancer，Pancreatic cancer。肿瘤坏死因子（TNF）通过促进炎症因子释放来诱导细胞凋亡，其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与胰岛素抵抗有密切关系，机制可能与激活NF-κB信号通路，抑制胰岛素信号传导有关，此外，血清TNF-α水平与糖尿病肾病病程成正相关，可能机制在于产生炎症因子，增加微血管通透性，从而损伤肾小球组织[30-31]；神经营养素通过调节胆碱能递质，调控细胞凋亡，调节突触可塑性影响糖尿病脑病，可能机制是由于高血糖高血脂诱发的神经营养素-3（NT-3）分泌减少[32-33]。小陷胸汤治疗痰热互结型糖尿病的分子通路主要涉及激素水平调节、脂肪代谢促进、细胞营养吸收、神经系统异常缓解以及癌症炎症抑制。

消渴丸对肺热津伤证糖尿病发挥治疗作用的通路为Hepatitis B，Pathways in cancer，FoxO signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，Jak-STAT signaling pathway等，包括以下3个方面：随着糖尿病的传变，大多数核心靶标参与改善机体免疫功能失调和炎症反应，说明机体已出现细胞因子风暴和炎症瀑布反应，Osteoclast differentiation激活免疫，除了炎症感染外，也有癌症相关通路，如Pancreatic cancer，Prostate cancer等；机体进一步虚弱，其核心基因还参与细胞能量转化通路cAMP signaling pathway和基本功能通路Apoptosis，Jak-STAT signaling pathway等；此外，通过FoxO signaling pathway参与糖代谢，Thyroid hormone signaling pathway调节甲状腺激素水平和Dopaminergic synapse调节神经系统等多种途径降低血糖。其他通路中PI3K-Akt与mTOR信号通路已被证明与胰岛β细胞功能相关[34]。PI3K-Akt通路是胰岛素的主要下游通路，与葡萄糖代谢有着密切关系，该通路被抑制可引起胰岛素抵抗进而发生2型糖尿病[35]。研究显示，激活PI3K-Akt和mTOR信号通路，显著增加胰岛β细胞的数量和体积，反之促进凋亡[36-37]。故消渴丸治疗肺热津伤证糖尿病的作用机制主要涉及抑制炎症癌症因子、提高机体能量转化和物质代谢、调节激素水平和神经系统。

玉泉丸治疗气阴两虚型糖尿病的核心靶点富集得到PI3K-Akt signaling pathway，FoxO signaling pathway，mTOR signaling pathway，AMPK signaling pathway等通路，包括以下3个方面：1）癌症炎症相关通路，包括Pathways in cancer，Hepatitis B，Prostate cancer，Central carbon metabolism in cancer，Proteoglycans in cancer；2）神经激素调节通路，Circadian entrainment，Thyroid hormone signaling pathway，Estrogen signaling pathway；3）细胞能量物质代谢通路，cAMP signaling pathway，AMPK signaling pathway，Apoptosis，FoxO signaling pathway。玉泉丸治疗气阴两虚型糖尿病抑制以下过程发挥部分治疗作用：肾小球系膜细胞中Jak-STAT通路被高血糖激活，导致肾小球系膜细胞过度增殖；甲状腺激素分泌异常，过多加速胰岛素降解，过少影响糖脂代谢[38]；长期高血糖促进破骨细胞形成，造成骨量减少甚至骨质疏松，从而导致糖尿病骨代谢异常[39]。所以，玉泉丸治疗气阴两虚型糖尿病的分子机制主要涉及癌症炎症抑制、神经和激素调节、能量物质代谢增加。

杞菊地黄丸中山茱萸等药材通过T cell receptor signaling pathway，Hepatitis B等通路提高免疫功能，抑制炎症反应，通过Rap1 signaling pathway等通路提高心肺功能，从而达到补益肝肾和回阳救逆的作用。有研究证实，Rap1b可能通过调节线粒体生源基因，从而减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡损伤[40]。同时糖尿病后期患者出现癌症等并发症，杞菊地黄丸作用于癌症相关通路，如Pathways in cancer，Prostate cancer，Colorectal cancer，Central carbon metabolism in cancer。患者在危重期可能出现急性疾病和恶性肿瘤，杞菊地黄丸可能通过Acute myeloid leukemia，Endometrial cancer，Melanoma通路发挥治疗作用。因此，杞菊地黄丸主要通过影响Acute myeloid leukemia，Endometrial cancer，Melanoma等恶性肿瘤通路，并作用于T细胞受体治疗肝肾阴虚证糖尿病，从而达到抑制重症癌症和提高机体免疫能力的功效。

“病证结合”等中医思维和“态靶结合”的分子生物学理念相结合，是解决目前病证结合作用机制不明确难题的有效路径。将宏观的症状、总结的证候与微观的靶标综合分析，针对疾病进行靶向性治疗，从而达到精准治疗的目的，为疾病的中药治疗提供了新的思路。本文从“方证对应”切入，采取“病证结合”的思维，探析方剂治疗疾病证候的作用机制，诠释了方剂治疗中医证候的科学内涵，为糖尿病的临床治疗提供参考。