槲皮素调控关节炎软骨细胞胆固醇代谢的机制研究

肖嘉聪 麦嘉乐 张罡瑜 何琪 杨均政 潘兆丰 王海彬

1. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510000 2. 广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科实验室，广东 广州 510000 3. 广州市正骨医院，广东 广州 510000 4. 广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广东 广州 510000

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是临床上常见的关节退行性疾病，其主要特征是软骨破坏、滑膜炎症、骨赘形成和软骨下骨重塑[1-3]。近些年的研究表明，骨关节炎不仅是一种与机械压力和衰老相关的关节疾病，也是一种与“代谢综合征”相关的疾病[4]。代谢综合征包括胰岛素抵抗、肥胖、高血压和血脂异常，其中胆固醇代谢和骨关节炎存在显著的相关性[5-6]。在骨关节炎期间，软骨细胞中出现脂质代谢失调和胆固醇累积[7]。Choi等[8]的研究表明，靶向调控 CH25H/CYP7B1/RORα 轴能够改善关节炎软骨细胞中的胆固醇代谢，从而减轻骨关节炎。

槲皮素是一种天然存在的黄酮类化合物，存在于大量的水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抑制胆固醇合成等功效[9-11]。槲皮素能够直接清除自由基、抑制脂质过氧化，减弱促炎细胞因子的表达，并且对新脂肪酸和胆固醇的合成产生快速和直接的抑制作用[12]。有研究表明，槲皮素能够减轻关节炎小鼠炎症指数、减轻关节的破坏、发挥抗炎作用[13]。这些证据表明，槲皮素能在骨关节炎的发生和发展中发挥保护作用。

本研究以骨关节炎中的胆固醇代谢为切入点，探讨槲皮素是否能够通过调控骨关节炎软骨细胞中的胆固醇代谢，减轻软骨细胞炎症和细胞外基质降解。

1 材料和方法

1.1 药品及试剂

槲皮素(纯度>98 %，CAS：117-39-5)，购自上海源叶生物科技有限公司；IL-1β购自派普泰克生物科技公司；胎牛血清、DMEM/F12 培养基购自赛默飞生物公司；总胆固醇检测试剂盒购自索莱宝生物科技公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)购自碧云天生物公司；引物合成由北京擎科生物公司完成，所有引物序列见表1；一抗CH25H、CYP7B 1、RORα、MMP3、MMP13 和β-actin购自美国Abcam公司；二抗购自武汉博士德生物公司。

1.2 小鼠软骨细胞分离培养及鉴定

从广州中医药大学实验动物中心[生产许可证号：SYXK(粤)2018-0092]购买3周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠，过量麻醉处死。取双膝关节分离软骨并剪碎，先用含有0.25 %胰蛋白酶-EDTA的培养基预消化30 min，然后使用含0.1%Ⅱ型胶原酶的培养基消化6 h，离心收集细胞，将细胞培养在含有10 %胎牛血清和1 %抗生素的 DMEM/F12 培养基中。细胞每2天更换1次培养基，当细胞融合至80 %～90 %时进行传代。P1、P2代软骨细胞用于后续实验。软骨细胞使用甲苯胺蓝染色鉴定。

1.3 小鼠软骨细胞骨关节炎模型建立及分组

本研究使用IL-1β(10 ng/mL)刺激软骨细胞模拟体外骨关节炎环境。细胞分为对照组、模型组(IL-1β，10 ng/mL)、低浓度组(IL-1β+5 μmol/L槲皮素)、高浓度组(IL-1β+10 μmol/L槲皮素)。

1.4 CCK-8 检测软骨细胞增殖

将软骨细胞接种到 96 孔板(每孔 5×103个细胞)中，细胞贴壁后，在含或不含IL-1β的培养基中加入不同浓度的槲皮素(0、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)干预24 h，干预结束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测波长 450 nm 处的吸光值。

1.5 细胞内总胆固醇(TC)水平检测

将软骨细胞以每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板，干预 24 h 后按照总胆固醇检测试剂盒说明书检测软骨细胞内胆固醇水平。简而言之，用异丙醇提取细胞内总胆固醇，超声裂解，高速离心后取上清，加入检测工作液，在500 nm处检测吸光值。制作标准曲线，计算各组细胞内总胆固醇水平。

1.6 qRT-PCR

将软骨细胞以每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板，干预结束后，收集细胞，使用Trizol试剂提取总RNA，用 PrimeScript RT reagent 试剂盒将 1 μg 总 RNA 反转录成 cDNA。采用 SYBR Green 染色法，以各组 cDNA 为模板，加入缓冲液、引物等进行 PCR。采用以下参数进行PCR扩增: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共40个循环，最后延伸步骤65 ℃ 5 s，0.5 ℃增量60 s。以18 s为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对mRNA表达量。所有引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 Western blot

将软骨细胞以每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板，干预结束后，收集细胞，加入含 1 %蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液冰上裂解细胞，14 000 r/min离心15 min，取上清，使用BCA Kit(碧云天)检测蛋白浓度。蛋白样品和Loading Buffer按照4∶1比例配置，100 ℃加热5 min，放-80 ℃冰箱储存以供后续使用。使用10 % SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，随后转移到 PVDF膜，用5 %脱脂牛奶于室温温下封闭 2 h，加入一抗CH25H、CYP7B1、RORα、MMP3、MMP13、β-actin孵育，4 ℃过夜，TBST 清洗3次，二抗孵育1.5 h，TBST 清洗 3 次，使用凝胶成像仪进行成像。以β-actin作为内参，使用Image J 进行定量分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 槲皮素对软骨细胞增殖的影响

CCK-8结果显示，10 μmol/L浓度以下的槲皮素对软骨细胞无毒性，而高浓度(25、50、100 μmol/L)的槲皮素会抑制软骨细胞增殖(图1C)。与对照组比较，IL-1β诱导的小鼠软骨细胞活力受到抑制(P<0.05)，而1、2.5、5、10 μmol/L槲皮素能减轻IL-1β对软骨细胞的增殖抑制(图1D)。因此，我们选择5、10 μmol/L浓度的槲皮素进行后续实验。

注：与对照组比较，*P<0.05，**** P<0.0001；与模型组比较，# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001。图1 A 槲皮素的化学结构式；B 甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞；C槲皮素对软骨细胞的毒性影响；D 槲皮素对 IL-1β诱导小鼠软骨细胞增殖的影响Fig.1 A, Chemical structural formula of quercetin; B, Identification of chondrocytes by toluidine blue staining; C, Toxic effect of quercetin on chondrocytes; D, Effect of quercetin on IL-1β-induced chondrocyte proliferation in mice

2.2 槲皮素对软骨细胞细中总胆固醇水平的影响

结果显示(图2)，模型组总胆固醇水平较对照组升高(P<0.05)；与模型组相比，槲皮素干预后的关节炎软骨细胞内总胆固醇水平有所降低(P<0.05)。这表明，槲皮素能够调控关节炎软骨细胞内的胆固醇代谢。

注：与对照组比较，* P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。图2 槲皮素对IL-1β诱导小鼠软骨细胞细中总胆固醇含量的影响Fig.2 Effect of quercetin on IL-1β-induced total cholesterol content in fine mouse chondrocytes

2.3 槲皮素对软骨细胞中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Col2a1、Il-6的mRNA 表达的影响

结果显示(图3)，与对照组比较，模型组中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Il-6的mRNA表达均有不同程度升高，而Col2a1的mRNA表达下降；相比于模型组，槲皮素组中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Il-6的mRNA表达有所下降，Col2a1的mRNA表达有所提高。这些结果表明，槲皮素能够调控CH25H/CYP7B1/RORα信号通路，减轻关节炎软骨细胞中的炎症和细胞外基质降解。

注：与对照组比较，** P<0.01，*** P<0.001，**** P<0.0001；与模型组比较，# P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。图3 槲皮素对软骨细胞中Cyp7b1、Ch25h、RORα、Mmp3、Mmp13、Col2a1、Il-6的mRNA表达的影响Fig.3 Effect of quercetin on the mRNA expressions of Cyp7b1, Ch25h, Rorα, Mmp3, Mmp13, Col2a1 and Il-6 in chondrocytes

2.4 槲皮素对 CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3 和 MMP13 蛋白表达的影响

结果显示(图4)，与对照组比较，模型组软骨细胞中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3 和 MMP13 蛋白的表达均有不同程度上升，而槲皮素能够部分抑制关节炎软骨细中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3和MMP13的蛋白表达(P<0.05)。这与qRT-PCR的结果一致。

注：与对照组比较，** P <0.01，*** P <0.001，**** P<0.0001；与IL-1β组比较，# P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，#### P<0.0001。图4 槲皮素对软骨细胞中CYP7B1、CH25H、RORα、MMP3和MMP13的蛋白表达的影响Fig.4 Effect of quercetin on the protein expressions of CYP7B1, CH25H, RORα, MMP3, and MMP13 in chondrocytes

3 讨论

随着人口老龄化与肥胖人口的增加，骨关节炎的发病率越来越高，随着病情的进展，晚期骨关节炎的患者只能通过手术来缓解疼痛，这给社会带来了严重的经济负担[14-15]。目前，临床上用于治疗骨关节炎的非甾体类抗炎药和阿片类药物只能暂时缓解疼痛，并不能延缓骨关节炎的进展[16]。此外，长期服用此类药物容易导致心血管疾病[17]。因此，努力寻找可以缓解骨关节炎进展的药物是骨关节炎新药研发中的重要策略之一。

炎症和细胞外基质降解是骨关节炎发展的关键因素[18-19]。IL-1β会导致促进炎症因子IL-6的释放，当炎症因子不断释放时，会引起软骨细胞功能障碍甚至凋亡，最终导致骨关节炎的发生[20-21]。细胞外基质(ECM)降解会导致关节严重疼痛，运动能力丧失，进行性不可逆功能障碍，而基质金属蛋白酶(MMPs)被认为是细胞外基质降解的关键分子[13]。MMP3和MMP13作为关节炎中的两种关键酶，会随着疾病的进展而表达增高，并不可逆地降解Ⅱ型胶原，造成关节软骨的破坏和炎症的发生[22-23]。我们的研究表明，IL-1β诱导后的软骨细胞中MMP3、MMP13、IL-6的表达均有不同程度上升，Col2a1的表达有所下降；槲皮素处理后部分下调了MMP3、MMP13、IL-6的表达，上调了Col2a1的表达。这表明，槲皮素对关节炎软骨细胞具有抗炎和延缓细胞外基质降解的作用。

骨关节炎不仅仅是关节软骨的局限性病变，还涉及全身的代谢异常，特别是胆固醇代谢紊乱，与骨关节炎的发生和发展有着密不可分的关系[24-25]。虽然胆固醇是维持细胞活性和功能不可或缺的物质，但胆固醇的过度累积会抑制软骨细胞基质的合成和分泌，并破坏细胞膜的结构和功能，导致细胞损伤甚至死亡[26]。综上所述，胆固醇代谢与骨关节炎的发生和发展密切相关。因此，改善关节炎软骨细胞胆固醇代谢可能成为治疗骨关节炎的新途径。我们的研究发现，使用IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞中的总胆固醇水平较对照组升高，槲皮素处理后软骨细胞中总胆固醇水平较模型组降低，这表明槲皮素能够调控关节炎软骨细胞内的胆固醇代谢，发挥软骨保护作用。

细胞内胆固醇累积会导致细胞功能受损，大多数细胞都有严格的胆固醇流入和流出系统来防止细胞内胆固醇积累[27]。胆固醇 25-羟化酶(CH25H)和25-羟基胆固醇7α-羟化酶(CYP7B1)是参与胆固醇代谢的重要基因，RORα是维甲酸相关孤儿受体家族成员之一，在炎症、脂质代谢等方面起重要的作用[8,28]。Li等[29]的研究发现，靶向调控CH25H/CYP7B1/RORα轴能够直接调节MMP3和MMP13的表达，改善骨关节炎的进展。我们的研究发现，IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞中CYP7B1、CH25H、RORα的基因和蛋白表达均有不同程度上升，而槲皮素降低了它们的表达。这表明，槲皮素能够抑制关节炎软骨细胞中CH25H/CYP7B1/RORα信号通路的激活，调节关节炎软骨细胞中的胆固醇代谢。

综上所述，我们的研究发现槲皮素能够改善关节炎软骨细胞中的胆固醇代谢、炎症以及细胞外基质降解，这可能是通过调控CH25H/CYP7B1/RORα信号通路来实现的。但是，本研究未能从体内证明这些结果，因此存在一定的局限性，我们将在后续的实验中为槲皮素治疗骨关节炎提供更多的理论支持。