茯苓枸杞饮提取工艺及其对黄嘌呤氧化酶作用

陈安利， 陈艳熙， 马 卓

(湖北工业大学生物工程与食品学院， 湖北 武汉 430068)

长期体内嘌呤代谢活跃、摄入嘌呤量过多或尿酸无法正常排泄，均会导致高尿酸血症，从而诱发痛风等疾病[1]。黄嘌呤氧化酶(XOD)主要参与体内嘌呤的代谢，通过催化次黄嘌呤和黄嘌呤的氧化羟基化反应产生尿酸(UA)，是产生UA的关键酶[2]。XOD活性过高会导致产生UA增多，从而引发高尿酸血症。XOD抑制剂是治疗痛风的主要药物，国内使用最多的XOD抑制剂为别嘌呤醇、苯溴马隆、非布司他等[3]。这类药物虽对痛风有很大的缓解作用，但是对肾脏的损伤也较大。因此，有待研发新的对XOD有抑制作用且对人体伤害较小的XOD抑制剂。

茯苓是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，药典记载茯苓味甘、淡、平，归肺、脾、肾经，有利水消肿的功效，是一种较为常见的利尿中药[4]。且有关研究表明，茯苓中含有大量的多糖和三萜酸类化合物，具有抗炎、保肝、利尿等生理活性[5-7]。郭花斌[7]等研究发现，茯苓提取液可减少肾小管对尿酸的重吸收，并通过抑制XOD的酶活性达到降低尿酸的作用；枸杞属于茄科枸杞属的落叶灌木植物[9]，其中含有多种生物活性成分，主要有多糖、类胡萝卜素、类黄酮、甜菜碱等，具有补肾、补脏、抗氧化和抗肿瘤等作用[10-11]；桑葚作为药食同源中药材，含有黄酮、多糖、花色苷、多酚等生物活性成分，具有抗氧化、防衰老、补肝益肾等保健作用[12-13]。均可作为研发XOD抑制剂的参考。

本实验通过考察茯苓、枸杞、桑葚等药食同源中药材的最佳提取工艺，得到其最佳提取工艺，并通过体外XOD活性检测，判断茯苓枸杞饮的抑制效果。旨在为开发预防和治疗痛风药食同源产品提供基础和思路，也是为茯苓枸杞饮的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茯苓、枸杞、桑葚等(均购于武汉市一家中药药店，经湖北省中医院冯汉鸽主任药师鉴定符合《中国药典》2020版标准)。

葡萄糖标准品(HP，博美生物科技有限公司)；黄嘌呤氧化酶(50 U/mg，上海麦克林生物科技有限公司)；黄嘌呤(色谱纯≥99.5%，上海麦克林生物科技有限公司)；苯酚、浓硫酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、甲醇(均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器与设备

RE-2000A旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；YH02211805025双光束紫外分光光度计(上海佑科科技有限公司)；鼓风干燥箱；DK-8D电热恒温水浴锅(予华仪器有限公司)；TEG16G高速台式离心机(上海精宏有限公司)；DS-5510超声波清洗器(予华仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1提取方法选择对于中药材，煎煮法是最为传统的提取方式[14]，是药食同源中药材最安全、较经济的提取方法，该方式在现代食品、药品加工中也有广泛的应用，适合食品药品加工生产大规模进行。并且茯苓枸杞饮中含有丰富的多糖、黄酮类化合物、萜类化合物等，这些有效成分均可溶于水。所以本实验选择水煎煮法对茯苓枸杞饮进行提取制备。

1.3.2提取液制备按照给定的处方量，称取一定比例的茯苓、枸杞、决明子等药材，共85 g，加入一定量的水煎煮，合并浸提液后趁热用200目滤布过滤，减压浓缩，根据药典规定提取液的相关要求，浓缩至所得提取液的相对密度为1.08左右。

1.3.3茯苓枸杞饮中多糖得率的测定由于茯苓枸杞饮中茯苓及枸杞含有大量的多糖，且研究表明[15]，茯苓多糖可以通过上调rOAT1的表达以及下调r URAT1的表达，从而增加了尿酸的排泄，起到治疗痛风的作用。因此，可选用测定多糖含量作为指标，采用苯酚-硫酸法[16]进行测定。

1)标准曲线的建立 精密称取葡萄糖标准品，用紫外分光光度计进行测定。以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线(图1)，得线性回归方程为y=0.012x-0.0128,R2=0.9995 ，表明葡萄糖标准曲线在10 ～50 mg范围内线性关系较好。

图1 葡萄糖标准曲线

2)多糖得率的计算 多糖得率

式中：m1表示总糖含量，mg；m0表示还原糖含量，mg；M表示药材干重，g。

1.3.4干膏得率的测定将蒸发皿干燥至恒重m0，精密吸取提取液置于恒重的蒸发皿中，精密称定质量m1，水浴上蒸干提取液得浸膏，于105 ℃下干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，快速精密称定质量m2。干膏得率

1.3.5单因素实验设计

1)加水倍数：按照处方量称取茯苓枸杞饮，共85 g，加入4、6、8、10、12倍水，煎煮2 次，每次2 h；

2)煎煮时间：按照处方量称取茯苓枸杞饮，共85 g，加入6倍水，煎煮2 次，每次煎煮30、60、90、120、160 min；

3)煎煮次数：按照处方量称取茯苓枸杞饮，共85 g，控制煎煮次数为1、2、3次，加入6倍水，每次煎煮60 min。

通过对多糖得率和干膏得率进行比较，得最佳单因素条件。

1.3.6正交实验设计根据前期单因素实验，选择加水倍数、煎煮时间、提取次数为水提工艺的主要因素，按三因素三水平表进行 L9(34)正交实验，以多糖得率、干膏得率为评价指标进行实验(表1)。

表1 茯苓枸杞饮正交实验设计

1.3.7验证实验按照最终优化工艺条件，做3份平行实验，分别测定多糖得率和干膏得率，若实验结果与正交试验结果相近，说明优化的工艺条件具有可行性。最终得到由85 g药材制成300 mL溶液。

1.3.8茯苓枸杞饮与苯溴马隆对XOD酶活力的影响黄嘌呤在 XOD 的作用下可以产生UA，产物UA在特定的波长下可作为检测XOD抑制率的依据。参考陈雨涔等采用的方法[17-18]，对实验条件进行优化。

1)检测波长的确定 利用紫外分光光度计在250～350 nm波长范围内扫描波长，来检测黄嘌呤与XOD的反应产物的最佳检测波长。

2)酶浓度与吸光值的关系 配置不同浓度的XOD，酶浓度分别为50、100、200、400、800 μg/mL，加入1 mL黄嘌呤启动反应，在最佳反应波长下进行检测，以酶浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘图，确定最适酶溶液浓度。

3)茯苓枸杞饮与苯溴马隆对XOD酶活力的检测 样品的配置：在最佳工艺条件下，取0.1 mL茯苓枸杞饮加入在0.2 mL最佳浓度的XOD中，再取2 mL缓冲溶液混匀，36 ℃静置2 h，加入1 mL黄嘌呤启动反应，进行检测；阳性对照的配置：将苯溴马隆取2.0 mg，用1 mL缓冲溶液溶解后，同上取0.1 mL后进行处理检测；空白对照排除试剂本身对实验的干扰。

对XOD的抑制率

式中：A0表示阴性对照组吸光值；A1表示阳性(样品)对照组吸光值；A2表示阳性(样品)空白组吸光值；A3表示阴性空白组吸光值。

根据85 g药材制成300mL的茯苓枸杞饮合剂。分别测定浓度为283，200，100，50，15. 625 mg/mL 的茯苓枸杞饮合剂对 XOD 的抑制率，将茯苓枸杞饮合剂浓度与抑制率进行回归，得到回归方程，计算抑制率为50%时的药物浓度，即半数抑制浓度( IC50)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

根据图2可知，茯苓枸杞饮的最佳工艺条件为加水倍数为8倍、浸提时间60 min、浸提次数2次。分析可知：

(a)加水倍数

(b)煎煮时间

(c)浸提次数图2 单因素实验结果

1)随加水倍数的增加，多糖得率和干膏得率呈先增加后下降趋势，可能原因是当加水量过少，饮片未能浸泡完全，有效成分及其他物质溶出率低；当加水量过多，饮片中的有效成分已充分溶出，加水只能改变体积，起到稀释作用，从而降低。当加水倍数为8倍水时，多糖得率和干膏得率达到最大值。

2)随着煎煮时间的增加，多糖得率和干膏得率呈现先增加后下降的趋势，可能是提取时间太短使得饮片中溶出的成分过少；长时间提取会使溶出的成分被破坏。多糖得率和干膏得率在提取1 h时达到最大值。

3)多糖得率和干膏得率在提取2次后达到最大值，可能原因是提取次数过少，饮片成分不能充分溶出；提取次数过多，溶出的成份被破坏或成分之间发生相互作用使含量降低。

2.2 正交实验结果分析

2.2.1正交结果分析根据上述单因素实验结果，选择加水倍数、煎煮时间、提取次数为水提工艺的主要因素，按单因素考察结果设置的水平进行正交试验。

根据主观权重赋权法，参考相关文献[17]，得出综合评分的权重系数为：多糖得率(70%)、干膏得率(30%)，试验结果如表2所示。

表2 正交实验结果

R值的大小反映了实验中各因素对所测指标的影响程度，R值越大则表示该因素对实验结果的影响越大。由表2可知，根据综合权重比较，浸提次数对实验指标的影响最大的，其次是加水倍数和浸提时间。初步分析得最佳工艺为：加8倍水、浸提3次、每次90 min。

2.2.2方差分析方差分析结果见表3，可知浸提次数有显著差异，与上正交分析表结果相同。考虑成本等因素，综合考虑最佳提取工艺为：8倍水先浸泡30 min后，浸提3次，每次90 min。

表3 综合方差分析

2.3 验证实验

按照正交实验最优条件(加8倍水，提取3次，每次90 min)，做3次平行，测得多糖得率及干膏得率，结果如表4所示。实验结果综合评分为31.22±0.026分，比正交结果好且数据稳定，说明该工艺条件具有可行性。

表4 验证实验结果

2.4 茯苓枸杞饮与苯溴马隆对XOD酶活力的影响结果分析

2.4.1最佳检测波长的确定

由图3可知，黄嘌呤和尿酸分别在270 nm和290 nm处有最大吸收波长，将不同浓度的XOD中加入黄嘌呤启动反应，如图4所示，均在290 nm处有最大吸收波长，且证明黄嘌呤与XOD反应后的产物为UA。

图3 黄嘌呤与尿酸扫描波长

图4 不同浓度XOD底物扫描波长

2.4.2最佳XOD浓度的确定由图5可知，在10～100 μg/mL范围内，加入黄嘌呤的XOD反应体系的吸光度随着浓度的增加而不断增加。当浓度达到200 μg/mL时，吸光度达到最大，为1.884，之后随着浓度的增大吸光值在1.884范围上下波动。综上，最佳XOD浓度为200 μg/mL。

图5 吸光值与XOD浓度关系

2.4.3茯苓枸杞饮对XOD活力的影响

根据表5可知，茯苓枸杞饮对XOD活力的抑制率可达到43.79%，与苯溴马隆抑制率62.99%较接近，由此可作为预防痛风，抑制尿酸生成的预防型保健品。

表5 抑制率表

3 结论

通过单因素和正交实验可知，茯苓枸杞饮的最佳工艺条件为加8倍量的水、浸提时间60 min、浸提次数2次。且通过重复性实验验证，按此工艺参数，可制备品质稳定的茯苓枸杞饮饮品。且在290 nm处、酶浓度200 μg/mL条件下，茯苓枸杞饮相对于苯溴马隆，对XOD一定的抑制作用，且抑制率为(43.76±0.685)%。该实验为后期研发具有预防痛风的功能性食品提供了实验基础和思路。

StudyonExtractionTechnologyofPoriaCocosand