雨生红球藻油柔性纳米脂质体冻干粉的制备与评价

张雨凝， 郑茗冉， 贾海强， 吴振， 刘智阳， 王立强

(1. 华侨大学 医学院， 福建 泉州 362021；2. 厦门大学 药学院， 福建 厦门361100；3. 贵州中铭生物科技有限公司， 贵州 贵阳 550001)

雨生红球藻油(haematococcus pluvialis oil，Hpo)是通过对雨生红球藻生物精炼除杂后得到的富含虾青素(Astaxanthin， ASTA)的深红色油状液体，不仅含有丰富的ASTA，而且还含有叶黄素[1]、生育酚[2]、植物甾醇[3]、大量的不饱和脂肪酸[4]，是一种强效的抗氧化剂，具有丰富的生物活性，如抗癌、抗糖尿病、抗炎，以及保护神经、心血管、眼睛和皮肤等[5]，可应用于化妆品、功能性食品、医药制剂、饲料等领域中，营养与药用价值极高.然而，Hpo及其有效成分ASTA不溶于水、稳定性[6]与皮肤渗透性差、生物利用度低等，严重限制了它的应用.

药物纳米载体不仅具有通过口服输送难溶性药物的潜力，而且在皮肤给药领域同样也具有很强的优势[7]，特别是基于脂质的药物纳米载体[8].柔性纳米脂质体(flexible nano liposomes，FNL)指的是在普通脂质体磷脂双分子层的基础上加入不同的膜柔软剂，获得高度变形能力的一种新型脂质体[9].FNL作为一种生物相容纳米载体，本身安全无毒，不仅可以提高难溶性药物的溶解度，达到药物控释缓释的目的，促进药物的吸收，提高口服生物利用度，还可以利用其变形性，提高药物在皮肤角质层的透过率，可作为不同药物的透皮载体.基于此，本文制备一种雨生红球藻油柔性纳米脂质体冻干粉(Hpo-FNL-LP)，为功能性油脂与ASTA纳米载体的研发与应用提供参考.

1 实验部分

1.1 实验仪器

1200型高效液相色谱仪(图像二极管阵列(DAD)检测器，美国安捷伦公司)；超声波清洗仪(河南省巩义市予华仪器有限责任公司)；VS-2500M型漩涡混合器(江苏省无锡市沃信仪器制造有限公司)；真空干燥箱(广东省广州市深华生物技术有限公司)；台式高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪(上海市黄海药检仪器有限公司)；RC-806D型溶出实验仪(天津市天大天发科技有限公司)；纳米粒度及Zeta电位分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)；真空冷冻干燥机(北京市松源华兴生物技术有限公司)

1.2 实验试剂

雨生红球藻油、虾青素微囊粉(合肥省安徽市德宝生物科技有限公司)；虾青素对照品、胆固醇、吐温-80、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、三氯醋酸钠、硫代巴比妥酸(上海市易恩化学技术有限公司)；甲醇、石油醚、丙酮、正己烷、无水乙醚(广东省汕头市西陇化工股份有限公司)；二氯甲烷、盐酸(北京市国药集团化学试剂有限公司)；磷酸盐缓冲盐溶液、PEG-400(上海市阿拉丁生化科技有限公司)；蛋黄卵磷脂PC-98T(上海市艾伟拓医药科技有限公司)；氢氧化钠(上海市麦克林生化科技有限公司).

1.3 实验材料

27只SD大鼠(雄性大鼠，质量为200～250 g，购自福建省福州市吴氏试验动物研究中心，试验动物使用许可证号为SCXK(闽)2016-0002).

2 实验结果与分析

2.1 Hpo-FNL-LP的制备

采用熔融乳化法制备Hpo-FNL，将20.0 g·L-1(在磷酸盐缓冲溶液中，下同)的蛋黄卵磷脂与5.0 g·L-1的胆固醇放入烧杯中，加入5 mL无水乙醇超声溶解.将烧杯置于65 ℃水浴锅中，加热至溶剂完全挥发，加入2.2 g·L-1Hpo与12.1 g·L-1吐温-80，充分搅拌均匀后，再加入50 mL0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4).溶液超声至分散均匀后，将烧杯置于磁力搅拌器上恒温，搅拌30 min，过0.22 μm微孔滤膜整粒，即得Hpo-FNL.将Hpo-FNL转入样品瓶中，加入160.0 g·L-1甘露醇，经-80 ℃的冰箱冷冻24 h后，放入真空冷冻干燥机中干燥36 h，即得Hpo-FNL-LP.

2.2 ASTA体外质量浓度测定

2.2.1 吸收波长的测定 将甲醇-二氯甲烷(V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=4∶1)溶液作为空白对照，使用紫外可见分光光度计对10.0 μg·mL-1的ASTA对照品溶液与Hpo-FNL-LP供试品溶液进行200～800 nm范围内扫描，测得ASTA的最大吸收波长为477 nm，且Hpo-FNL-LP中的其他成分对ASTA的吸收波长无干扰.

2.2.2 高效液相色谱条件 色谱柱为依利特Sino Chrom ODS-BP(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，流动相为纯乙腈，检测波长为477 nm，流速为1.0 mL·min-1，进样量为20 μL.

2.2.3 专属性的考察 分别取ASTA对照品溶液、FNL-LP空白溶液和Hpo-FNL-LP供试品溶液，过0.45 μm微孔滤膜后，在节2.2.2色谱条件下检测，测得ASTA在对照品与供试品溶液中的保留时间基本一致，且空白对照无干扰.

2.2.4 线性关系 精密量取2.5 mg的ASTA对照品，用甲醇-二氯甲烷溶液溶解并定容至50 mL，得到50.0 μg·mL-1的ASTA对照品储备液.精密移取适量储备液，并加入甲醇-二氯甲烷溶液，依次稀释至4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5 μg·mL-1.

在节2.2.2色谱条件下进样检测，以峰面积为纵坐标(Y)，以ASTA质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，绘制标准曲线，线性回归方程为Y=284.26x+5.649 2，相关系数R2=0.999 8.结果表明，ASTA在1.5～4.5 μg·mL-1质量浓度范围内线性关系良好.

2.2.5 方法的考察 制备质量浓度为4.0 μg·mL-1的ASTA对照品溶液，在节2.2.2色谱条件下进行检测，连续测定6次，测定的相对标准偏差为0.09%，这说明该仪器精密度良好.平行配制6份4.0 μg·mL-1的ASTA对照品溶液，在节2.2.2色谱条件下进行检测，测得的相对标准偏差为1.33%，说明该方法具有较好的重现性.制备空白FNL-LP并分别加入适量ASTA对照品溶液，配制质量浓度分别为1.5，3.0和4.5 μg·mL-1的回收率供试品溶液各3份，过滤后，在节2.2.2色谱条件下进样检测，测得的回收率分别为(100.64±0.97)%，(99.99±1.17)%，(100.13±1.19)%，相对标准偏差分别为0.96%，1.17%，1.19%，说明该方法较准确.

2.3 Hpo-FNL-LP的质量评价

2.3.1 包封率 精密量取2.0 mL Hpo-FNL-LP复溶液于15 mL离心管内，加入3.0 mL石油醚，涡旋30 s后，在4 ℃，2 000 r·min-1的条件下离心5 min，取下清液加适量甲醇和二氯甲烷溶液破乳，在节2.2.2色谱条件下进行检测，根据标准曲线计算ASTA质量浓度，得到包封在脂质体里的药物质量浓度(ρ(包))；另取同样量Hpo-FNL-LP直接加适量甲醇和二氯甲烷溶液破乳，在节2.2.2色谱条件下进行检测，根据标准曲线计算ASTA质量浓度，得到总的ATSA质量浓度(ρ(总)).Hpo-FNL-LP的包封率(δE)的计算公式为

(1)

测得的Hpo-FNL-LP的包封率为(89.16±1.21)%.2.3.2 载药量 量取一定质量的Hpo-FNL-LP，在一定体积(V)的25 ℃蒸馏水中复溶，待其完全溶解后，在节2.2.2色谱条件下进行检测，其载药量(W)的计算公式为

(2)

测得Hpo-FNL-LP的载药量为(1.34±0.04)%.

2.3.3 粒径及Zeta电位 粒径分布图，如图1所示.图1中：I为强度；d为粒径.通过纳米粒度及Zeta电位分析仪，直接测定复溶后的Hpo-FNL-LP的粒径、Zeta电位.测定得到的Hpo-FNL-LP的粒径为(165.75±0.11) nm，聚合物分散性的指数为(0.132±0.016)，Zeta电位为-(18.45±0.48) mV.

图1 粒径分布图

2.3.4 形态的观察 Hpo-FNL与Hpo-FNL-LP的透射电镜图，如图2所示.由图2可知：Hpo-FNL外观为双层膜的圆形结构；Hpo-FNL-LP复溶后颗粒完整，粒径大小与冷冻干燥前无明显差别.

(a) Hpo-FNL (b) Hpo-FNL-LP

2.3.5 稳定性 将Hpo-FNL与Hpo-FNL-LP在4 ℃和25 ℃条件下放置30 d，并分别在0，5，10，20，30 d时进行渗漏率、粒径、丙二醛(MDA)质量浓度的测定，以考察稳定性.按2.3.1包封率测定方法计算Hpo-FNL-LP内包封的ASTA质量浓度，渗漏率(δP)计算公式为

(3)

式(3)中：ρ0为0 d时的Hpo-FNL内包封的ASTA质量浓度，ρt为td时的Hpo-FNL内包封的ASTA质量浓度.

Hpo-FNL，Hpo-FNL-LP稳定性结果，如表1所示.表1中：ts为储藏时间；θ为储藏温度；δP为泄漏率；c为浓度.

表1 Hpo-FNL，Hpo-FNL-LP稳定性结果

由表1可知：在4 ℃条件下储藏30 d时，Hpo-FNL的泄漏率与粒径均无明显变化，MDA的浓度增加0.96 mmol·L-1，而Hpo-FNL-LP泄漏率无明显变化，粒径随储藏时间延长稍有增大，MDA的浓度增加0.26 mmol·L-1；在25 ℃条件下储藏30 d时，Hpo-FNL泄漏率高达(25.88±0.45)%，粒径减小，MDA的浓度增加1.24 mmol·L-1，而Hpo-FNL-LP泄漏率为(7.62±0.73)%，粒径随储藏时间延长稍有增大，MDA浓度仅增加0.33 mmol·L-1；与Hpo-FNL相比，Hpo-FNL-LP的泄漏率与MDA浓度均降低，稳定性明显提高，可有效延长Hpo-FNL的储藏时间.

2.4 体外溶出评价

根据2020版《中华人民共和国药典》四部通则0931项溶出度和释放度测定法第2法(桨法)[10]进行体外溶出度测定.制备并精密量取Hpo-FNL-LP复溶液与雨生红球藻油乙醇溶液(Hpo-ES)各10.0 mL，将其装于预处理好的透析袋(相对分子质量为14 000)内.将透析袋分别置于装有400.0 mL释放介质的溶出仪中，释放介质为人工胃液(SGF，含质量分数为2.0%的吐温-80)与人工肠液(SIF，含质量分数为2.0%吐温-80)，温度设定为(37.0±0.5) ℃，搅拌速度设定为100 r·min-1.

依次在0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，48 h取样，每次取样2.0 mL并过0.45 μm微孔滤膜，同时补充等量释放介质，按照节2.2.1条件取滤液进行检测，并计算药物累计释放率.体外累计释放曲线，如图3所示.图3中：tr为释放时间；Q为累计释放量.由图3可知：在SIF，SGF中，Hpo-FNL-LP的释放明显较Hpo-ES缓慢(P<0.05)，24 h释放比较迅速，6 h时累计释放率分别达到(45.89±1.83)%与(38.45±2.03)%，48 h累计释放率达到(93.71±1.21)%，(55.15±1.47)%.

图3 体外累计释放曲线图

2.5 体外透皮评价

2.5.1 离体皮肤的准备 将SD大鼠断颈处死后，先使用脱毛膏脱掉其腹部皮肤表面的毛发，脱毛过程不宜过长，否则会损伤皮肤，再使用刮毛刀剔除未脱净的毛发.剔除完毕后，剪下大鼠完整的腹部皮肤，将皮下脂肪组织全部切除，并保持整个皮肤的完整性.用生理盐水将皮肤洗净后浸泡其中，放入4 ℃的冰箱内保存，24 h内使用.

2.5.2 体外透皮试验 使用扩散池法测定体外透皮.将节2.5.1得到的大鼠腹部皮肤夹在立式扩散池中间，其角质层面朝释放池，真皮层面朝接受池.释放液分别为2.0 mL等质量浓度的Hpo-FNL-LP复溶液、雨生红球藻油普通脂质体冻干粉复溶液、雨生红球藻油(Hpo-OS)溶液，而接收液为质量分数40%的PEG-400生理盐水溶液.扩散池温度设定为(32.0±0.5) ℃，搅拌速度设定为300 r·min-1.

分别在1，2，3，4，6，8，10，12，24 h吸取接收液0.7 mL，并过0.45 μm滤膜，同时，补加等量接收液，取滤液在节2.2.2色谱条件下进行检测，并计算各时间的单位累计渗透量Qn(μg·cm-2).

单位累计渗透量曲线图，如图4所示.图4中：tp为渗透时间.由图4可知：Hpo-FNL-LP在前4 h内透皮迅速，24 h后单位累计渗透量达到(12.84±0.36) μg·cm-2，显著高于Hpo-LPO-LP与Hpo-OS组，说明用柔性纳米脂质体包载Hpo后更利于ASTA透过皮肤.

图4 单位累计渗透量曲线

2.5.3 皮肤滞留试验 将完成体外透皮实验后的大鼠腹部皮肤取出，用生理盐水溶液反复进行冲洗，去除皮肤表面残留的接收液和样品溶液，用滤纸吸干表面水分.剪碎鼠皮，并将其放入15 mL离心管中，加入3.0 mL甲醇-二氯甲烷溶液，涡旋30 s后，水浴超声30 min，3 000 r·min-1离心5 min，重复3次，合并上清液，在节2.2.2色谱条件下进行检测，并计算皮肤滞留量Qs(μg·cm2).

表2 皮肤滞留量实验结果

2.6 ASTA体内质量浓度测定方法

2.6.1 高效液相色谱条件 色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，流动相为V(甲醇)∶V(水)=90∶10，检测波长为477 nm，流速为1.0 mL·min-1，进样量为20 mL.

2.6.2 血浆样品的处理 取0.6 mL大鼠眼眶的血，将其置于1.5 mL含有肝素钠的离心管(EP)中，在4 ℃，3 500 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，即得血浆，放-20 ℃的冰箱储藏备用.

取200.0 μL血浆置于1.5 mL的离心管中，加入1.0 mL的丙酮-正己烷(V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶1)溶液，涡旋1 min后，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液于3 mL离心管中，继续向残渣沉淀中加入1.0 mL丙酮-正己烷溶液，重复操作一次，合并上清液.在25 ℃下真空干燥至完全，用50 μL的甲醇-二氯甲烷溶液复溶，10 000 r·min-1离心10 min，取40.0 μL上清液进样检测.

2.6.3 专属性的考察 将大鼠空白血浆、含药血浆与体内血浆按节2.6.2方法处理后，在节2.6.1色谱条件下进样分析，空白血浆、含药血浆与体内血浆的HPLC图，分别如图5所示.图5中：S为电信号；tf为色谱柱流出物的流出时间.

(a) 空白血浆

由图5可知：ASTA在6 min左右出现峰值，且血浆对其测定无干扰，峰型较好，表明该色谱条件下的体内分析方法专属性良好.

2.6.4 线性关系 配制质量浓度为0.012 5，0.025，0.075，0.125，0.175，0.250，0.375，0.500 μg·mL-1的大鼠含药血浆，经处理后分别在节2.6.1色谱条件下进样检测.以峰面积为纵坐标(Y)，以ASTA质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，线性回归方程为Y=354.37x+4.466 5，R2=0.999 1，表明体内血浆中ASTA在0.012 5～0.500 0 μg·mL-1质量浓度范围内线性关系良好.

2.6.5 方法的考察 制备质量浓度分别为12.5，125.0，500.0 ng·mL-1的3种低、中、高大鼠含药血浆，按节2.6.2方法处理血浆后，在节2.6.1色谱条件下进样分析.根据色谱条件进样检测，连续测定了6次，测定其相对标准偏差分别为1.76%，0.54%，1.33%，连续测定6 d，测定其相对标准偏差分别为3.25%，1.53%，0.91%，表明该方法日内、日间精密度良好.

制备上述3种质量浓度大鼠含药血浆各5份，分别于室温存放12 h，在-20 ℃的冰箱连续冻融3次，存放一个月后，按节2.6.2方法处理血浆后，在节2.6.1色谱条件下进样检测，测定其相对标准偏差分别为0.87%～4.35%，1.80%～3.91%，0.81%～3.78%，表明该方法稳定性良好.制备上述3种质量浓度的含药血浆各3份，按节2.6.2方法处理血浆后，在节2.6.1色谱条件下进样检测，测得血浆中ASTA回收率为100.47%～103.28%，相对标准偏差为1.37%～2.27%，表明该方法回收率良好，方法较准确，符合体内方法学的要求.

2.7 动物实验

精密量取适量ASTA对照品溶于植物油中，配制成质量浓度为3.0 g·L-1的ASTA-OS；精密量取适量Hpo溶于植物油中，配制质量浓度为3.0 g·L-1的Hpo-OS；精密量取适量市售虾青素微囊粉(ASTA-MSP)，用蒸馏水溶解并定容至100 mL.

将24只健康的雄性SD大鼠随机分为4组(ASTA-OS组、Hpo-OS组、Hpo-FNL-LP组、ASTA-MSP溶液组，n=6)，前两组按ASTA质量与大鼠的质量比为60 mg·kg-1灌胃给药，后两组按ASTA质量与大鼠的质量比为10 mg·kg-1灌胃给药，分别在0，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，36，48，60 h时，取眼眶血，按节2.6.2方法处理血浆后，在节2.6.1色谱条件下进样检测，大鼠体内的平均血药质量浓度-时间曲线，如图6所示.图6中：重复次数n=6；ρave为大鼠体内的平均血药质量浓度.

图6 大鼠体内的平均血药质量浓度-时间曲线

大鼠药代动力学参数，如表3所示.表3中：t1/2为半衰期；ρmax为血药达峰的质量浓度；AUC为给药时曲线下面积；tmax为达峰时间；tmr为平均滞留时间；F为生物利用率；与ASTA-OS组相比，其他组a表示P>0.05；与Hpo-OS组相比，其他组b表示P<0.01；与ASTA-MSP组相比，其他组c表示P<0.01.由表3可知：大鼠口服Hpo-FNL-LP与口服ASTA-OS，Hpo-OS，ASTA-MSP相比，消除半衰期t1/2延长，ρmax，tmax，AUC0-60均增大，相对生物利用度高达(422.53±3.30)%，显著高于ASTA-MSP与Hpo-OS组，说明Hpo-FNL-LP有效提高了ASTA的口服生物利用度.

表3 大鼠药代动力学参数

2.8 数据分析

3 讨论

脂质体为液体制剂，在长期储藏中存在磷脂氧化水解、芯材药物泄露、颗粒聚集产生沉淀等[11]现象，文献[12]表明，将脂质体通过冷冻干燥法固化成冻干粉，可有效提高其稳定性.稳定性实验结果表明，与冻干前的Hpo-FNL相比，Hpo-FNL-LP的泄漏率与脂质氧化程度明显降低，可有效延长Hpo-FNL的储藏时间.

体外溶出的实验结果表明，Hpo-FNL-LP的释放明显较Hpo-ES缓慢(P<0.01)，不存在突释现象.这是由于体外释放曲线最符合一级动力学，具有一定缓释效果，且释放机制主要以Fick扩散机制为主[13-14].体外透皮与皮肤滞留量的实验结果表明，Hpo-FNL-LP在24 h的皮肤累计渗透量为(12.84±0.36) μg·cm-2，皮肤滞留量为(4.49±0.10) μg·cm-2.与Hpo-OS与Hpo-LPO-LP相比，Hpo-FNL-LP显著提高了ASTA的皮肤渗透性且增加了ASTA的皮肤滞留量，有利于其作为外用皮肤制剂，可预防皮肤老化与损伤，提高皮肤对紫外线的免疫功能.

口服药动学研究发现，即使ASTA-OS与Hpo-OS给药浓度是其他制剂的6倍，Hpo-FNL-LP与ASTA-MSP的ρmax，t1/2和AUC0-60仍显著大于ASTA-OS与Hpo-OS(P<0.01)，表明两种制剂均极大延长了ASTA的体内吸收时间，并提高了吸收能力，在体内实现缓慢的释放，克服了ASTA口服生物利用度低的缺点，且Hpo-FNL-LP的相对生物利用度优于ASTA-MSP.原因可能是Hpo及其有效成分ASTA难溶于水，体内代谢快，不易被胃肠吸收.制成Hpo-FNL-LP或ASTA-MSP后，ASTA被脂膜或囊壳包裹，在水中以胶束的形式分散，极大提高了其水溶性，促进其吸收.其中，Hpo-FNL-LP特有的磷脂双分子层膜是一种类生物膜，具有极强的生物相容性，且其粒径比ASTA-MSP小，更容易分散，因此，生物利用度更高，将其以口服给药的方式应用，具有更广阔的前景.

制备的Hpo-FNL-LP显著提高了Hpo及其有效成分ASTA的水溶性、稳定性、皮肤渗透性，以及口服生物利用度，为功能性油脂与ASTA纳米载体的研究开发与应用提供参考.下一步将对其安全性进行研究，以确保Hpo-FNL-LP可安全地应用于各种领域中.