CPNE1在肿瘤中的研究进展

王硕，朴大勋，任硕

【提要】 本文旨在研究CPNE1的结构及其生物学作用，CPNE1在肿瘤发生发展中的作用及其分子生物学机制，以及CPNE1在肿瘤治疗、预后中的作用等。CPNE1是一种高度保守的钙依赖型磷脂结合蛋白，属于Copines家族。CPNE1在N端有一对C2结构域，在C端有一个A结构域。CPNE能够将目标蛋白招募到磷脂表面，调节它们的活性和细胞内的定位，还可能提供信号通路之间的串扰机制。CPNE1在多种肿瘤中存在高表达现象，通过多种途径促进肿瘤的发生发展，CPNE1基因被确定为癌基因。

肿瘤是威胁全球人类身体健康的一类重大疾病，其发病机制复杂。尽管近年来肿瘤治疗方法的开发取得了显著进展，但发病率和死亡率仍居高不下且大多数晚期肿瘤患者的预后并没有得到显著改善。在全身治疗过程中，化疗耐药的发生是大多数恶性肿瘤患者术后复发的一个主要原因。此外，现存的生物学标记物对于肿瘤诊断筛查、预后评估的敏感性和特异性均不理想。因此，研究肿瘤的分子机制，寻找新的高敏感性和特异性的生物标志物及分子靶标对肿瘤的诊疗和预后都极为重要。CPNE1是一种高度保守的钙依赖型磷脂结合蛋白，主要分布在细胞质中。CPNE1在正常组织中多呈低表达，但CPNE1在非小细胞肺癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌、骨肉瘤、结直肠癌等恶性肿瘤中均有高表达，且其高表达促进肿瘤的发生发展，这表明了CPNE1在正常组织和恶性肿瘤中存在表达差异。有研究证实，CPNE1可与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)相互作用参与肿瘤的发生发展[1]。此外，CPNE1可与Micro RNA相互作用调节肿瘤的增殖和侵袭能力[2]。但CPNE1作用肿瘤的分子机制仍不太明确，因此需要进一步探究CPNE1作用肿瘤侵袭转移的分子机制、信号通路及作用靶点。这对肿瘤的预防、诊疗和预后评估具有极为重要的意义。

1 CPNE1概述

1.1 CPNE1结构

CPNE1 蛋白是 Copines 家族中第一个被研究者发现的成员，是由 Creutz 在进行研究分离草履虫偶联蛋时首先发现的[3]，其位于人第 20 号染色体上，可编码 537 个氨基酸[4]。CPNE1蛋白由CPNE1基因编码，主要分布在细胞膜和细胞质中，CPNE1是一种高度保守的钙依赖型磷脂结合蛋白。CPNE1在N端有一对C2结构域(C2a和C2b)[5]，C2结构域是一个钙依赖的磷脂结合基序，最初发现于蛋白激酶C，C2结构域中包含有对钙和磷脂结合非常重要的天冬氨酸残基[6]，C2结构域还具有钙依赖的磷脂结合活性，这些残基很可能会直接影响到CPNE蛋白对Ca2+刺激的亚细胞定位[7]，CPNE1的C2结构域可能参与细胞信号和或膜转运途径[4]。在C端有一个A结构域，A结构域是从血管性血友病因子中得知的，血管性血友病因子是一种血浆和细胞外基质蛋白[8]，A结构域促进CPNE1与多种细胞内蛋白的结合[9]。研究表明，CPNE1与肿瘤的发生发展密切相关。

1.2 CPNE1生物学作用

目前已有20多种蛋白质被确定为CPNE靶标，其中许多是参与细胞内信号传导的蛋白质，如有丝分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase1，MEK1)/细胞外调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)、蛋白磷酸酶5、CDC42调节的蛋白激酶以及NEDD8结合酶泛素C12[4,9]，CPNE能够将这些目标蛋白招募到磷脂表面，这表明它们可能会调节它们的活性和细胞内的定位，以响应细胞内钙离子水平的变化。有研究表明，CPNE1C2结构域在海马前体HiB5细胞的神经元分化中具有关键的钙非依赖性作用，可能与激活蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号有关。AKT已被发现参与多种生物学过程，包括细胞迁移、侵袭和存活[10]。有报道称CPNE1可通过磷酸化残基473上的AKT促进神经元分化[11]。并证明了这些事件与细胞内Ca2+水平或和CPNE1定位没有强相关性[12]。有研究证实，C-Jun激活区结合蛋白1(C-Jun activation region binding protein 1,JAB1)通过CPNE1中的C2A结构域与JAB1中的MPN结构域的结合来激活CPNE1的神经元分化能力[13]，14-3-3γ通过与HIB5细胞中CPNE1C2a结构域的结合来激活CPNE1的神经元分化能力[14]。此外，CPNE1介导的神经元分化可以被HiB5细胞中的HCLS1 相关蛋白 X-1 表达抑制[15]。CPNE1被证实是体外肌肉发生的修饰基因。原发性干燥综合征患者泪液分析显示CPNE1过表达。CPNE1和RBM12在人、小鼠和斑马鱼中均存在启动子和5′UTR共享。

1.3 CPNE1对信号通路调节作用

由于CPNE在细胞中有多个靶点，它们的表达可能会受到信号通路激活的调节，因此这一蛋白家族通常可能提供信号通路之间的串扰机制。在人胚胎肾293细胞中，来自肿瘤坏死因子-α受体的信号通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)以Ca2+依赖的方式受到CPNE1的调节。CPNE和NF-κB信号通路之间可能存在的直接联系表现为NEDD8结合酶泛素C12和CPNE1A结构域之间的相互作用[4]，NEDD8结合酶UBC12通过泛素连接酶复合物SCFβTrCP促进核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)的降解[16-17]，CPNE可能通过激活泛素C12而促进I-κB的降解，从而增强NF-κB信号转导。CPNE显性-阴性结构可降低NF-κB被肿瘤坏死因子-α激活的能力，该结构可能通过泛素C12的失调或错位来抑制肿瘤坏死因子-α信号转导。通过激活M胆碱能受体或应用离子载体A23187将钙引入人胚肾293细胞，可增强肿瘤坏死因子-α依赖的NF-κB的激活。钙的这种作用完全被CPNE显性-阴性结构所阻断。所有显性-负性结构的作用均可被全长CPNE1的过表达所逆转，提示该结构通过竞争性抑制CPNE发挥特异性作用[10]。

2 CPNE1在几种常见肿瘤中表达

研究发现，CPNE1在非小细胞肺癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌、骨肉瘤、结直肠癌等多种肿瘤中均有不同程度的表达，其表达水平与肿瘤的发生发展有关。采用免疫印迹实验和免疫组织化学方法检测CPNE1蛋白的表达，采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测 CPNE1 mRNA 的表达。以下总结了几种常见肿瘤中的表达情况，分析其临床意义。

2.1 CPNE1与非小细胞肺癌

肺癌是人类癌症死亡的主要原因[18]。非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的85%[19]，其主要分为鳞状细胞肺癌、肺腺癌和大细胞癌[20]。非小细胞肺癌的预后极差，5年生存率仅为15%[21]。所以，阐明非小细胞肺癌的发病机制及发生发展过程，寻找新的治疗靶点极为重要。研究证实CPNE1蛋白在正常肺组织表达量显著低于非小细胞肺癌组织，且CPNE1的表达水平与临床分期呈正相关，与肿瘤大小和肿瘤分化程度等无关。此外，CPNE1基因敲除可抑制NSCLC细胞的生长、细胞周期进程和迁移[22]。另有研究表明CPNE1在非小细胞肺癌亚型间存在差异表达，与肺腺癌相比，鳞癌患者的CPNE1表达水平较高，但鳞癌患者miR-195-5p的表达水平较低，而生存率明显较低。功能分析证明miR-195-5p的过表达直接靶向CPNE1通过调节EGFR信号通路来抑制了NSCLC来源的细胞的增殖、迁移和侵袭[23]。转染miR-195-5p模拟物之后，CPNE1在蛋白和mRNA水平的表达均下调，通路分析表明，p-AKT、p-Erk和Snail在肺腺癌和鳞状细胞系中的表达均降低。这表明miR-195-5p调控可能是非小细胞肺癌各亚型CPNE1表达差异的原因之一[23]。此外，CPNE1也可激活非小细胞肺癌中的c-MET来促进癌症发展[24]。以上证明，CPNE1是非小细胞肺癌中的癌基因，CPNE1蛋白高表达促进非小细胞肺癌的发生发展，有可能成为治疗非小细胞肺癌的分子靶点和非小细胞肺癌患者预后评估的重要指标。

2.2 CPNE1与前列腺癌

前列腺癌是老年男性最常见的癌症类型之一,其亚洲发病率持续上升[25]。研究表明，CPNE1在正常前列腺组织的表达水平显著低于前列腺癌，且发现与去势抵抗性前列腺癌相比，非去势抵抗性前列腺癌的CPNE1表达水平低下[26]。此外，发现CPNE1的表达水平与前列腺癌患者的肿瘤分期，格里森评分和生存率显著相关。TCGA数据的共表达分析表明CPNE1与肿瘤坏死因子受体相关因子2(Tumor necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2)表达显著相关。通过蛋白质印迹和免疫荧光分析确定，CPNE1的过表达可以上调前列腺癌DU-145细胞中的TRAF2表达[26]。这表明CPNE1是预测前列腺癌生化无复发生存率的预后因子，而且与前列腺癌中TRAF2的表达量呈明显正相关。CPNE1可能通过其C2结构域来促进前列腺癌的发生发展，其发生机制及分子通路还需进一步探索研究。以上表明CPNE1可能影响前列腺癌的发展和进展，至少部分是通过上调TRAF2的表达来实现的。

2.3 CPNE1与三阴性乳腺癌

乳腺癌是女性癌症死亡主要原因。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)中雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体均为阴性，对人表皮生长因子受体靶向治疗和内分泌治疗无效[27]。且与放射治疗后局部复发的高风险相关[28]。因此，急需寻找新的生物标志物并阐明其作用机制。研究表明，CPNE1在TNBC组织表达水平明显高于正常乳腺组织，并与肿瘤大小、远处转移和生存率有关[29]。CPNE1在体外可抑制细胞凋亡及TNBC的放射敏感性，且沉默AKT信号抑制了CPNE1介导的TNBC发生发展和放射抗性，此外，体内研究也证实，CPNE1基因敲除可抑制肿瘤增殖[29]。总之，CPNE1通过激活AKT来促进TNBC发生和放射抗性。结果表明CPNE1可以被认为是TNBC患者的一个预后因素。此外，靶向CPNE1有望成为TNBC潜在的新治疗方案，有助于预测特定TNBC患者的放射敏感性，并有助于肿瘤细胞的增敏，从而改善TNBC患者的放射治疗结果。

2.4 CPNE1与骨肉瘤

骨肉瘤是青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤之一[30]。虽然骨肉瘤在各方面治疗上获得了较大进展，但转移性骨肉瘤患者的预后依旧很差[31]。研究骨肉瘤的分子机制，寻找新的标志物对骨肉瘤的诊断、治疗和预后都极为重要。CPNE1沉默能抑制人骨肉瘤细胞增殖。CPNE1在骨肉瘤组织中表达量明显高于正常骨组织。功能研究证实，CPNE1基因敲除可显著抑制Saos-2和HOS细胞的增殖、侵袭和转移[3]。CPNE1基因敲除导致Saos-2细胞周期阻滞于G2/M期和G0/G1期。有分析表明，CPNE1沉默下调了许多与肿瘤发生和发展相关的蛋白的表达，包括RAS、MEK1/2、WNT1、β-catenin、cyclin A1、IRAK2和CIAP2[3]。此外，CPNE1下调增强了Saos-2细胞对顺铂和阿霉素的敏感性。

2.5 CPNE1与结直肠癌

结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一。结直肠癌的危险因素包括消化道疾病(溃疡性结肠炎、克罗恩病、大肠腺瘤、直肠息肉)、家族性腺瘤性息肉病、结直肠癌家族史、血吸虫病、心理情绪紧张、缺乏体育活动、肥胖、亚硝胺及其化合物、吸烟、低纤维饮食[32]。虽然结直肠癌患者的新治疗方法的开发取得了重大进展，但接受根治性切除的患者的整体预后并没有显著改善[33]。因此，阐明潜在的病理过程以确定结直肠癌治疗的新靶点是很重要的。采用定量实时荧光定量PCR和免疫组化染色法检测CRC细胞中CPNE1的表达，结果显示CRC细胞中CPNE1的mRNA和蛋白上调。研究证明CPNE1通过激活AKT信号来促进CRC细胞增殖，抑制细胞凋亡，增加线粒体呼吸，增强需氧糖酵解，上调葡萄糖转运蛋白1和己糖激酶并下调裂解的Caspase-3的产量[34]。CPNE1也有助于CRC细胞的化学耐药性。CPNE1在结直肠癌细胞中被敲除会抑制肿瘤生长并增加肿瘤对奥沙利铂的敏感性[34]。CPNE1与结直肠癌发生发展的其他机制及对结直肠癌患者预后的影响有待进一步研究。

2.6 CPNE1与胃癌

CPNE1在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织,但CPNE8在胃癌发生发展中发挥着更为重要的作用，CPNE8高表达与胃癌的发生呈明显正相关,CPNE8低表达可明显抑制胃癌细胞增殖[35]。

3 CPNE1在治疗中的应用

CPNE1蛋白能够延缓冬凌草甲素诱导的细胞自噬及凋亡，其延缓作用与CPNE1调控泛素化结合蛋白p62蛋白的表达有关，并该延缓作用增强了肝癌细胞SMMC7721细胞对冬凌草甲素的耐药性。此外，研究表明淫羊藿苷能够呈浓度和时间依赖性抑制结肠癌细胞HT29增殖，阻滞细胞由G0/G1期向S期的发展，诱导结肠癌细胞HT29细胞凋亡，抑制细胞侵袭和迁移。淫羊藿苷干预结肠癌细胞后,CPNE1蛋白显著上调, 这提示淫羊藿苷抑制结肠癌细胞的增殖、转移, 诱导凋亡可能与CPNE1蛋白调节有关[36]。

4 结语

CPNE1是一种高度保守的钙依赖型磷脂结合蛋白。CPNE1在N端有一对C2结构域,C2结构域可能参与细胞信号和或膜转运途径,在C端有一个A结构域,A结构域促进CPNE1与多种细胞内蛋白的结合。正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白表达存在显著差异并会随着肿瘤的发生发展而改变。在非小细胞肺癌中，CPNE1通过调节EGFR和c-MET信号通路来调节细胞增殖。有研究证实，CPNE1可能是通过上调TRAF2的表达来促进前列腺癌的发展和进展。此外，CPNE1通过激活AKT来促进TNBC发生和放射抗性。CPNE1沉默能抑制人骨肉瘤细胞增殖和转移，此外，CPNE1下调增强了Saos-2细胞对顺铂和阿霉素的敏感性。CPNE1通过调节AKT-GLUT1/HK2途径增强结直肠癌细胞的生长，促进糖酵解和增加耐药性。综上所述，CPNE1在非小细胞肺癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌、骨肉瘤、结直肠癌等多种肿瘤中均有高表达，其高表达促进以上肿瘤的发生发展。但是CPNE1作用以上肿瘤的分子机制及作用靶点仍不太明确，需要进一步探究CPNE1 作用肿瘤侵袭转移的分子机制、信号通路，这为认识肿瘤的发生发展过程、发病机制，寻找高度敏感性、特异性的肿瘤标志物及新药物作用靶点提供理论依据，对肿瘤的预防、诊断、治疗、预后评估具有极为重要的意义。有研究显示，CPNE1可以与MEK在蛋白水平结合[4]，且我们基因检测发现CPNE1基因可以与MAP2K1基因相结合。MAPK信号通路激活为一种经典途径促进癌变，这使得该通路为抗癌靶向药物设计提供了一个有吸引力的平台。尽管在肿瘤诊疗方面已经取得了重大进展，但临床耐药性仍是个很大挑战[37]。肿瘤标志物的生成或在血液中的变化可提示肿瘤性质[38]，所以研究新的靶点及作用机制就显得尤为重要。因此我们猜测CPNE1可以通过MEK/ERK通路促进肿瘤增殖。EMT赋予细胞迁移和侵袭特性，细胞间黏附丧失和上皮标志物表达减少是其特征表现。那么CPNE1是否可以促进EMT有待研究。所以我们下一步将进行实验去探究CPNE1是否通过MEK/ERK通路促进肿瘤细胞增殖及CPNE1与EMT的关系。我们可以使用肿瘤芯片数据库和癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas，TCGA)对CPNE1表达进行数据分析。通过实时定量PCR、免疫印迹实验和免疫组织化学染色测量各个肿瘤组织中CPNE1表达情况。通过转染不同质粒使CPNE1沉默或过表达。通过细胞计数试剂盒-8评估细胞的增殖。通过transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。通过以上方法来进一步探究CPNE1在肿瘤增殖和侵袭方面的作用，这为提升癌症诊疗水平和提高癌症患者生存质量提供新思路。