基于Cu2O/AuNPs构建电流型免疫传感器检测载脂蛋白A1

张强艳, 齐继兰, 薛 颖, 孟 飞, 张晓蕾, 吴春勇, 刘元华, 杨功俊*

(1. 中国药科大学药学院, 南京 210009; 2. 南京医科大学附属肿瘤医院江苏省肿瘤医院, 南京 210009)

膀胱癌是男性人群中常见的发生于尿道组织的肿瘤, 具有较差的愈后和较高的病死率[1]．目前其发生、发展机制尚不明确, 所以早期诊断和愈后检查对于膀胱癌尤为重要[2]．临床上常用于膀胱癌的诊断技术是膀胱镜组织学及细胞学检查,具有创伤性、费时及费用昂贵等缺点[3]．肿瘤标志物是反映肿瘤发生发展情况的一种物质,对其不断地研究与发现为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新思路[4]．利用双向凝胶电泳及质谱等方法,研究者发现载脂蛋白A1(apolipoprotein-A1, Apo-A1) 在膀胱癌患者尿液中的浓度相对较高, 并与酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 检测结果一致, 因此可将其作为膀胱癌的一种肿瘤标志物[5]．目前常用于Apo-A1的检测方法有酶联免疫法 (ELISA)[6]、高效液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)[7]、电化学生物传感器[8]等．电化学免疫传感器具有操作简便、成本低、灵敏度高等优点, 为蛋白质的检测提供更便捷的方法[9]．金属纳米材料因具有较强的电子转移能力、较大的比表面积、优异的电催化作用及生物相容性而备受分析工作者的关注[10], 目前已有许多金属及金属氧化物等纳米材料如Cu2O[11]、Pd@AuNPs[12]、Fe3O4[13]等用于电化学免疫传感器的制备．其中, Cu2O因具有良好的电氧化还原信号而应用广泛[14], 且AuNPs具有良好的生物亲和力,分散性好, 因此常被分散于复合纳米材料中构建性能优异的免疫传感器[15-16]．本文采用在氧化亚铜纳米立方体表面原位还原Au3+制得氧化亚铜/金纳米颗粒(Cu2O/AuNPs)复合材料构建电化学免疫传感器, 利用Cu2O中铜元素的氧化峰电流在免疫反应前后的变化实现Apo-A1的快速检测,并成功用于实际样品分析．

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学实验在CHI 660E型电化学工作站(上海辰华仪器公司,中国)进行, 采用三电极体系: 玻碳电极(GCE, 直径3 mm)及其修饰电极为工作电极, 铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极．Cu2O/AuNPs复合物的形貌通过Quanta 250 FEG场发射扫描电子显微镜(FEI公司, 美国)进行表征, Cu2O的XRD由D8Advance多晶X射线衍射仪(Burker-AXS公司, 德国)进行表征．实验在(25±0.5) ℃条件下进行．

人源Apo-A1生物素抗体(Ab), 重组人源Apo-A1抗原均购自Abcam(中国上海); 五水硫酸铜, 抗坏血酸, 四水氯金酸(上海国药试剂有限公司, 中国); 氢氧化钠(广东西陇科学股份有限公司, 中国)．其他试剂均为分析纯, 溶液均由二次蒸馏水配制．

1.2 Cu2O/AuNPs的制备

1.3 免疫传感器的制备

图1 Cu2O/AuNPs的合成及电化学传感器的制备Fig.1 The synthesis procedure of the Cu2O/AuNPs and the preparation of the electrochemical immunosensor

1.4 Apo-A1的测定

将制得的免疫传感器与不同浓度的Apo-A1在37.5 ℃下孵育130 min后, 用0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)充分清洗以除去未发生特异性免疫反应的Apo-A1．将传感器置于一定体积的0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)溶液中进行示差脉冲伏安扫描,记录氧化峰电流, 依据Cu2O氧化峰电流在免疫反应前后的变化实现Apo-A1的检测．

1.5 实际样品的制备

本实验从江苏省肿瘤医院获得多次膀胱切除术后患者的血清和恶性膀胱肿瘤个人史患者的尿液样品．血清和尿液样品均用20倍体积的0.1 mol·L-1PBS (pH=7.4)稀释, 离心15 min(10 000 rpm)并静置15 min后收集上层清液, 并于4 ℃冰箱中保存．

2 结果与讨论

2.1 Cu2O/Au纳米复合材料的表征

图2 Cu2O(a～b)和Cu2O/AuNPs(c)的SEM图, Cu2O 的XRD图(d)和EDX能谱图(e～h)Fig.2 SEM image of Cu2O(a～b) and Cu2O/AuNPs(c), XRD of Cu2O(d), EDX mapping (e～g) and spectrum (h) of Cu2O/AuNPs

2.2 修饰电极的电化学表征

a. 裸GCE; b. Cu2O/AuNPs/GCE; c. CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE; d. Ab/GA/CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE; e. BSA/Ab/GA/CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE; f. Apo-A1/BSA/Ab/GA/CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE图3 (a) 不同修饰电极的电化学阻抗图谱; 阻抗Nyquist图(插图为拟合阻抗谱的Randles等效电路); (c) 不同修饰电极在0.1 mol·L-1 PBS (pH=7.4)中的循环伏安曲线．Fig.3 (a) Electrochemical impedance patterns of different modified electrodes; (b) Nyquist plots of impedance spectra, the inset is the equivalent circuit applied to fit the impedance spectra in the presence of the redox probe of 5 (c) Cycle voltammetry of immune process in 0.1 mol·L-1 PBS (pH=7.4).

表1 免疫传感器通过Randles等效电路拟合参数Tab.1 The parameters of immune sensor fitted by Randles equivalent circuit

2.3 条件优化

为了进一步优化电化学免疫传感器的性能,探讨了介质的pH值,反应温度和抗原抗体反应时间对免疫反应的影响．图4(a)为不同pH值对免疫反应前后电流强度变化的影响．实验结果显示,当介质的pH达到7.4时,免疫反应前后电流降低的变化值达到最大,故本实验选择pH=7.4的介质进行检测．图4(b)为反应温度对电流变化的影响．结果表明,当免疫反应温度为37.5 ℃时电流的变化最大．图4(c)为抗原抗体反应时间对电流变化的影响．从图4(c)可以看出,当免疫反应时间小于120 min时, 随着免疫反应时间的延长,电流逐渐增大;当免疫反应时间大于120 min时, 电流达到最大且基本保持不变,所以选择孵育时间为130 min．

图4 介质pH(a)、反应温度(b)和反应时间(c)对免疫反应前后电流变化的影响Fig.4 The effect of (a) medium pH, (b) temperature and (c) incubation time on the change of current intensity with 1.00 μg·mL-1 Apo-A1

2.4 线性范围和检测限

图5 (a)不同浓度Apo-A1的示差脉冲伏安图(a～h: 0, 10.0, 100, 1.00×103, 1.00×104, 1.00×105, 1.00×106, 1.00×107 pg·mL-1); (b) 电流强度变化值与Apo-A1浓度的关系(n=3)．Fig.5 DPV curves (a) and the linear relationship (b) of the immunosensors incubated with different concentration of Apo-A1(n=3)

2.5 电极的重复性、稳定性和选择性研究

在最佳实验条件下, 对同一个电极采用相同的方法制备5次,其电流强度变化值的RSD为3.3%; 采用相同的方法制备5根免疫传感器,其电流强度变化值的RSD为4.5%,表明该传感器具有良好的重复性和重现性．将免疫传感器在4 ℃下放置10 d后, 其电流响应值为初始值的90%, 说明该传感器具有良好的稳定性．

传感器的选择性通过将一定浓度的Apo-A1与5倍浓度的干扰蛋白(如Ig G, CEA)混合孵育, 其电流值变化与仅含Apo-A1的传感器进行比较,得到干扰蛋白引起的电流值变化小于5%,说明该传感器具有良好的选择性．

3 实际样品测定

按照1.5节的方法对样品进行前处理后,在最佳实验条件下,对样品溶液重复测定3次,结果如表3所示．表3结果显示,本文方法的样品回收率在97.37%～110.9%范围内, 相对标准偏差RSD小于4.2%, 表明该方法具有良好的准确性,有望应用于实际样品中Apo-A1的检测．

表3 实际样品中Apo-A1回收率测定Tab.3 The recovery of Apo-A1 in real samples

4 结论

本研究首次将重组Apo-A1 抗体成功地固定在Cu2O/AuNPs 纳米复合材料表面, 并制备电流型免疫传感器,成功建立了测定Apo-A1 的电化学方法．该免疫传感器具有较宽的线性范围、良好的重复性、选择性和稳定性, 并成功用于实际样品的检测,将为膀胱癌的诊断提供新的思路．