超声辅助提取茄皮酚工艺优化及其降血糖功效研究

关玉婷，陈瑞瑞, ，蔡如玉，范 蓓，孙 晶，张 瑞，张紫阳，常世敏,

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2.邯郸市天然产物与功能食品开发重点实验室，河北邯郸 056038；3.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

茄（Solanum melongenaL.）为茄科，茄属植物，在我国广泛种植，是一种高产作物，茄子的不同部位，如皮、肉和叶子，都含有丰富的生物活性物质，如类黄酮和酚类化合物。然而茄皮通常被当做垃圾进行处理，造成严重的环境问题和经济浪费[1]。茄皮作为一种副产品，含有丰富的酚类化合物，具有显著的抗氧化[2]、降血糖[3]和抑菌[4]等作用。将茄皮中的多酚进行提取，可提升茄子的附加值并降低环境压力。

Ⅱ型糖尿病是常见的代谢性疾病，对全球人民健康造成了巨大的威胁。国际糖尿病联合会公布2019年有4.63亿人（占全球人口的9.3%）患有糖尿病[5]。Ⅱ型糖尿病是由多种因素引起的代谢紊乱性疾病，例如遗传、生活习惯和环境等，其特征是缺乏胰岛素或胰岛素水平较低，导致血糖水平异常升高[6]。临床治疗Ⅱ型糖尿病常选用阿卡波糖或二甲双胍等药物，但患者会出现呕吐、腹泻等症状[7]，因此选用天然产物调控血糖水平具有重要意义。赵艳威等[8]研究表明苹果多酚可通过抑制α-葡糖苷酶活性降低糖尿病大鼠的血糖。厉成玲等[9]研究发现黑米多酚可有效刺激小鼠胰岛素分泌，改善Ⅱ型糖尿病小鼠恢复趋于正常血糖水平。

本研究采用超声辅助提取技术制备茄皮酚（EPP），以得率为指标对提取工艺进行优化，测定EPP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，评价其体外的降血糖作用，通过建立糖尿病小鼠模型，对EPP体内降血糖活性进行研究，既提升了茄皮的综合利用率，又为治疗Ⅱ型糖尿病提供了新的原料和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性昆明小鼠 实验动物饲养于北京市实验动物研究中心，4周龄（18～20 g），动物许可证号为SYXK（京）2020-0038，实验期间充分保证了实验动物的各项福利；紫黑色茄子 表皮颜色均匀无虫害，购于邯郸市丛台区美食林超市；硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；四氧嘧啶 美国Sigma公司；磷酸钾、碳酸钠 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

SB25-12DTD超声波清洗器、SCIENTZ-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；BPG-9100BH高热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；AL204型精密电子天平 梅特勒-托利多公司；SIGMA3K15台式冷冻离心机 曦瑪离心机（扬州）有限公司；UV-80005紫外分光光度计 上海方析仪器有限公司；ACCU-CHEK血糖测定仪 罗氏血糖健康医护公司。

1.2 实验方法

1.2.1 EPP提取 将新鲜无虫害茄子进行清洗，取茄皮置于45 ℃鼓风干燥箱中干燥5 h，干燥后的茄皮进行粉碎并过100目筛。在装有100 mL蒸馏水的锥形瓶中加入2.00 g干燥茄皮粉末，进行超声辅助提取，超声功率为420 W，提取30 min，结束后，8500 r/min离心15 min，收集上清液，冷冻干燥，得到EPP，称重并计算得率。

式中：Y为EPP得率，%；M1为EPP的质量，g；M0为茄皮粉末的质量，g。

1.2.2 单因素实验 以EPP的得率为指标，提取时间为50 min，提取温度为45 ℃，料液比为1:50 g/mL，探究最优超声功率（360、420、480、540、600 W）；以EPP的得率为指标，提取时间为50 min，超声功率为480 W，提取温度为45 ℃，探究最优料液比（1:40、1:45、1:50、1:55、1:60 g/mL）；以EPP的得率为指标，提取时间为50 min，超声功率为480 W，料液比为1:50 g/mL，探究最优提取温度（35、40、45、50、55 ℃）；以EPP的得率为指标，超声功率为480 W，提取温度为45 ℃，料液比为1:50 g/mL，探究最优提取时间（30、40、50、60、70 min）。

1.2.3 正交试验 在单因素实验基础上，以料液比、提取时间、超声功率和提取温度为因素，EPP得率为指标，采用正交试验L9（34）设计，对影响EPP得率的因素进行优化，见表1。

表1 正交试验因素和水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 EPP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率测定 根据黄春跃等[10]的方法进行调整，测定EPP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。用pH6.9，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲溶液分别配制2 mg/mL阿卡波糖溶液、0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液和0.2 mol/L的碳酸钠溶液；配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的浓度EPP溶液备用。37 ℃孵育10 min后加入2.0 mL碳酸钠溶液，反应终止后在405 nm处测定吸光值，α-葡萄糖苷酶溶液+EPP溶液吸光值记为OD1，EPP溶液吸光值记为OD2，α-葡萄糖苷酶溶液吸光值记为OD3，磷酸盐缓冲溶液吸光值记为OD4，2 mg/mL阿卡波糖溶液为阳性对照。

α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式为：

1.2.5 建立糖尿病小鼠模型 所有实验动物均饲养在北京市实验动物研究中心SPF级动物房中，充分保证了实验动物的福利，严格遵守了有关动物使用的道德规定。

随机选120只健康4周龄雄性昆明小鼠，禁食16 h，注射四氧嘧啶180 mg/kg·bw，注射体积为0.01 mL/g，建立Ⅱ型糖尿病模型小鼠；同时给予普通饲料自由采食，禁食8 h，采尾血，测定空腹血糖值。糖尿病小鼠建模成功标准：空腹血糖值大于10 mmol/L（参照《保健食品功能检验与评价方法（2020年版）》）。

1.2.6 降血糖试验 随机选取10只健康小鼠作为空白组，选取50只建模成功的小鼠，分为5组（n=10）：空白组（等体积无菌水），阳性对照组（1 mg/kg·bw的阿卡波糖溶液），模型组（等体积无菌水），高剂量组（1.5 g/kg·bw的EPP溶液），中剂量组（0.5 g/kg·bw的EPP溶液），低剂量组（0.25 g/kg·bw的EPP溶液），灌胃体积为10 mL/kg，同时给予普通饲料自由采食，连续灌胃4周，禁食4 h，采尾血，测定空腹血糖值[11]。

式中：W表示血糖下降率，%；BG0表示EPP干预前血糖值，mmol/L；BG1表示EPP干预后血糖值，

mmol/L。

1.2.7 糖耐量试验 小鼠试验4周禁食4 h后进行灌胃，20 min后每只小鼠灌胃葡萄糖溶液，剂量为2.0 g/kg·bw，分别测定灌胃后0、0.5、2 h的血糖值并记录血糖曲线下面积[12]。

式中：S表示血糖曲线下的面积；A0表示0 h血糖值；A1表示0.5 h血糖值；A2表示2 h血糖值。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0进行数据处理，显著性差异采用ANOVA，P＜0.05为具有显著性差异，P＜0.01为具有极显著差异，数据表示均采用均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

各因素对EPP得率的影响如图1所示，超声功率对EPP得率的影响呈先上升后下降的趋势，在480 W时，EPP得率最高达到39.21%，因过高的超声功率会造成EPP中黄酮、多酚类物质结构被氧化分解[13]，且过高的超声会产生热效应[14]，改变原料结构，降低了酚类物质的溶出，降低了EPP的得率。

图1 超声功率、料液比、提取温度和提取时间对EPP得率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power, solid-liquid ratio, extraction temperature and extraction time on the yield of EPP

EPP的得率随着料液比的变化呈先上升后下降的趋势，在料液比为1:50 g/mL时得率达到最大，为42.51%。表明料液比为1:50 g/mL时已基本完成对EPP的提取，增加溶剂已无法提升得率，甚至可能会增加冷冻干燥的负荷[15]。故1:50 g/mL为提取EPP的最佳料液比。

EPP的得率随着温度的变化呈先上升后下降的趋势，温度在35～45 ℃时，EPP得率随着温度增加而增加，且提取温度为45 ℃时，EPP得率高达41.2%；当温度高于45 ℃，EPP得率呈下降趋势；过高的提取温度导致EPP中的生物活性物质被分解，且溶剂挥发导致样液溶解度降低，从而降低了EPP的得率[16]，与胡栋宝等[17]的结果一致，利用适宜的提取温度可加快酚类物质溶出，同时需防止过高的提取温度破坏已经提取的多酚类物质。

EPP的得率随着提取时间的变化呈先上升后下降的趋势，当提取时间小于50 min时EPP的得率随提取时间的增加而升高；当提取时间大于50 min时，EPP的得率随提取时间的增加而降低，最优提取时间50 min为，得率为40.11%，与刘静等[18]研究结果一致，过长的提取时间会造成已溶出的EPP被氧化，导致EPP得率会随着提取时间的增加呈现出下降的趋势[19]。故提取EPP最佳超声时间为50 min。

2.2 正交试验结果

由表2、表3可知，影响EPP得率的顺序依次为：提取温度（C）＞提取时间（D）＞料液比（B）＞超声功率（A），且提取EPP的最佳工艺是A3B2C3D2，即提取温度50 ℃，提取时间50 min，料液比1:50 g/mL，超声功率540 W。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

进行了3次正交试验结果验证试验，测的EPP得率为43.21%，确认提取工艺最优参数为A3B2C3D2。

2.3 EPP对α-葡萄糖苷酶活性的影响

α-葡萄糖苷酶是关键的消化酶，抑制α-葡萄糖苷酶可降低消化率从而缓解餐后血糖。对于Ⅱ型糖尿病的治疗，可以利用抑制α-葡萄糖苷酶的活性从而抑制血糖水平的异常升高[20-22]。如图2所示，不同浓度的EPP对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，EPP浓度在0.2～1 mg/mL时，抑制率与EPP浓度呈正相关，1 mg/mL EPP抑制率为45.46%。而常国立等[23]研究发现1 mg/mL杨梅核多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制率高于90%且效果优于同浓度阿卡波糖的抑制率，可能是由于提取的EPP未进行纯化，导致相同浓度时，EPP的抑制效果较差。

图2 EPP对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.2 Inhibition rate of α-glucosidase by EPP

2.4 EPP对糖尿病小鼠体重的影响

糖尿病小鼠体重通常会出现缓慢增长甚至降低的状态。由表4可知，试验前后，空白组小鼠的体重与其他试验组均存在极显著差异（P＜0.01），表明建立糖尿病小鼠模型成功；阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组给药后体重均有所上升，但与模型组相比，均无统计学差异（P＞0.05）；EPP三个剂量组之间及与阳性对照组也均无显著差异（P＞0.05）。

表4 EPP对糖尿病小鼠体重的影响（g）Table 4 Effects of EPP on body weight of hyperglycemic mice (g)

2.5 EPP对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

空腹血糖值可以反映出机体血糖代谢的状况[24]。由图3可知，试验前，与空白组相比，糖尿病小鼠空腹血糖值均升高，具有极显著差异（P＜0.01），且注射四氧嘧啶的小鼠各组间空腹血糖值无显著差异（P＞0.05），表明糖尿病小鼠建模成功。经4周灌胃后，与空白组相比，模型组和低、中、高剂量组血糖值均升高，存在极显著差异（P＜0.01）；虽然低剂量组血糖值降低，但与模型组无显著性差异（P＞0.05），中剂量组存在显著差异（P＜0.05），阳性药组及高剂量组血糖值明显下降，存在极显著差异（P＜0.01）；与阳性药组相比，EPP干预的剂量组均存在极显著的差异（P＜0.01），但血糖值均高于阳性药组，表明EPP对降低空腹血糖水平有积极作用，但效果不及阿卡波糖治疗效果，这可能是由于注射四氧嘧啶对小鼠胰岛细胞造成了不可逆的损伤，EPP的干预仅能改善空腹血糖水平，而不能使其恢复至正常状态[25]。

图3 EPP对糖尿病小鼠空腹血糖的影响Fig.3 Effects of EPP on fasting blood glucose in hyperglycemic mice

由血糖下降率可知，模型组、阳性药组和EPP干预的三个剂量组血糖下降率均高于空白组，且存在极显著差异（P＜0.01）；阳性药和EPP干预均使之呈现出较高的血糖下降率，与模型组比，低剂量组存在显著差异（P＜0.05），阳性药组和中、高剂量组存在极显著差异（P＜0.01）；EPP干预的三个剂量组血糖下降率均低于阳性药物组，存在极显著的差异（P＜0.01），结论与空腹血糖值相同，且高剂量的EPP干对糖尿病小鼠的空腹血糖值预有更好的治疗效果。

2.6 EPP对小鼠糖耐量的影响

糖耐量可反映出机体对葡萄糖代谢的调节能力。由图4可知，给药0.5 h时，除空白组外，所有小鼠的血糖值均达到最高水平；与阳性药组相比，高剂量组0.5 h血糖值明显降低，具有显著差异（P＜0.05）。给药2 h后，灌胃葡萄糖溶液引起的血糖值波动基本消失；除空白组外其他实验组血糖值仍较高，且与空白组相比存在极显著差异（P＜0.01）；经低、中剂量EPP灌胃小鼠的血糖值与模型组相比无显著差异（P＞0.05），但经高剂量EPP灌胃小鼠的血糖值与模型组相比存在显著差异（P＜0.05）；与阳性药物组相比，低、中、高剂量组血糖值降低效果较差，低剂量组存在极显著差异（P＜0.01），中剂量组存在显著差异（P＜0.05），且经过EPP干预（如图5），血糖曲线下面积极显著降低（P＜0.01）。上述结论表明EPP的降血糖作用具有剂量依赖性，EPP能有效提升糖尿病小鼠的糖耐量，EPP可以改善糖尿病小鼠，降低小鼠机体葡萄糖的负荷，促进代谢，有效降低血糖值，与赵艳威等[8]研究结果一致。

图4 EPP对糖尿病小鼠糖耐量的影响Fig.4 Effects of EPP on glucose tolerance in hyperglycemic mice

图5 EPP对糖尿病小鼠血糖曲线下面积的影响Fig.5 Effects of EPP on area under the blood glucose curve in hyperglycemic mice

3 结论

本研究对紫黑色茄皮以蒸馏水为提取剂进行超声辅助提取，研究优化了EPP的提取工艺：最优超声功率为540 W，料液比为1:50 g/mL、提取温度为50 ℃、提取时间为50 min，此条件下EPP的得率为43.21%。通过对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率确定EPP具有体外降血糖功效，1 mg/mL的EPP在体外对α-葡萄糖苷酶抑制率为45.46%。利用EPP对糖尿病小鼠进行干预治疗，通过测定小鼠的体重、空腹血糖值及糖耐量，确定了EPP不会使正常小鼠的血糖代谢异常；对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用，且高剂量EPP具有更优的降血糖效果。这表明EPP具有治疗Ⅱ型糖尿病的潜力，且不会对正常的胰腺组织产生负面影响。但EPP的具体成分需进行进一步研究。本研究可提升茄皮的综合利用价值，为降血糖相关产品的开发提供新的研究思路。

表5 EPP对糖尿病小鼠血糖下降率的影响Table 5 Effect of EPP on hypoglycemic rate in diabetic mice