应用低分子肝素对≥2次着床失败患者妊娠结局的影响

姚文，远孝琼，姚青云，覃丹俞，李倪捷，黄勇，李豫峰

(华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心，武汉 453000)

2018年一项包含18 571对夫妇的横断面研究显示，中国育龄妇女中不孕症的患病率为15.5%，在有生育意向的人群中则高达25%[1]。辅助生殖技术(ART)作为治疗不孕不育疾病的重要手段，在近30年取得了极大进步。但胚胎着床依然是制约活产的关键因素，提高患者的着床率仍然是一大挑战。

低分子肝素(LMWH)是通过用不同的化学或酶法裂解肝素获得的平均分子量在4 500～5 000 Da、范围在1 000～10 000 Da的肝素盐。因其更安全有效且更可控而逐渐取代肝素广泛应用于临床[2]。LMWH具有抗凝抗栓作用，主要用于静脉血栓、心血管疾病和缺血性中风以及炎症性疾病[3]。此外，LMWH还可以通过与多种蛋白相互作用调控胚胎着床和发育的生理过程[4]。

多次着床失败的患者中出现获得性或遗传性血栓形成倾向的概率远高于正常患者[5-6]。一项Meta分析显示，LMWH可显著提高多次着床失败患者的活产率[7]。但另一项Meta分析则表明，LMWH对妊娠结局没有明显影响[8]。使用LMWH是否会改善多次着床失败患者的妊娠结局目前还需要进一步证实。

虽然反复着床失败(RIF)指3次及以上优质胚胎移植着床失败[9]，但在临床上2次着床失败患者即开始使用LMWH的情况比较常见，为了明确LMWH对≥2次着床失败患者妊娠结局的影响，遂进行本项研究，以期为临床上多次着床失败患者的诊疗提供依据。

资料与方法

一、研究对象

本研究为回顾性队列研究，纳入对象为2018年1月至2020年12月于我院生殖医学中心行冻融胚胎移植(FET)助孕患者的临床资料。纳入标准：(1)患者有2次及以上着床失败史；(2)均行FET。排除标准：(1)LMWH用药时间不足1月；(2)夫妻双方任何一方染色体异常；(3)供精或供卵周期；(4)有黄体转换但最终未移植；(5)失访。

按照纳排标准，共纳入2 140个解冻周期(1 547例患者)。根据是否使用LMWH分为LMWH组(n=182)和未使用LMWH的对照组(n=1 958)。本研究经同济医院伦理委员会审批通过(伦理批号：TJ-IRB20210956)。

二、研究方法

1.促排卵方案：根据患者情况主要采用激动剂方案、拮抗剂方案及其他方案进行促排卵。激动剂方案于月经周期第2天给予促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达必佳，辉凌制药，德国或达菲林，博福益普生，法国)3.75 mg，拮抗剂方案于月经周期第2天给予促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant,抑那通，武田药品，日本)3.75 mg，30 d后给予起始剂量的卵泡刺激素(FSH，丽申宝，珠海丽珠或果纳芬，默克雪兰诺，德国)(通常为150～300 U/d)，根据患者的身高、体重、卵巢反应、卵泡大小及数目等调整用量。当出现2个以上卵泡直径≥18 mm或3个以上卵泡直径≥17 mm时给予人绒毛膜促性腺激素(HCG，艾泽，默克雪兰诺，德国)10 000 U肌肉注射，34～36 h后进行取卵。

2.胚胎培养及FET：获卵后采用常规体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)授精，16～18 h后观察受精情况，并将正常受精的合子继续培养至卵裂胚或囊胚。胚胎根据患者情况遵循医生建议及患者意愿进行冻存或鲜胚移植。根据中华医学会生殖医学分会实验室学组共识[10]、Istanbul共识[11]和Gardner囊胚评分体系[12]将胚胎(包括卵裂胚和囊胚)分为优质胚胎、中等胚胎和劣质胚胎。将未移植的优质胚胎和中等胚胎进行玻璃化冻存。转化内膜3或5 d后快速解冻胚胎，放入胚胎复苏液(GMOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中5 min后转移至囊胚培养液(G2，Vitrolife，瑞典)中1～3 h后行FET。解冻后的胚胎存活总细胞数>50%认为胚胎复苏成功。

3. FET前内膜准备及黄体支持给药方法：对照组仅给予常规黄体转化和黄体支持，所用方法同既往研究[13]。具体方案为月经第2天开始按递增法口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)至内膜厚度达到7 mm及以上且雌激素作用时间不少于10 d时，给予黄体酮注射液(浙江仙琚制药)肌肉注射，40 mg/次，1次/d，转化内膜。移植后继续黄体支持直至测定血清HCG水平。LMWH组从解冻周期黄体转化日起一并给予那屈肝素钙注射液(速碧林，ASPEN Notre Dame de Bondeville，法国)皮下注射，4 100 U/次，1次/d或磺达肝癸钠注射液(泽瑞妥，江苏恒瑞)皮下注射，2.5 mg/次，1次/d，至B超下见到胎心搏动后停药。

4. 结果评价及随访：胚胎移植后12～14 d后测定血清HCG水平，血清HCG>10 U/L为HCG阳性。对于HCG阳性患者，28 d后行经阴道B超检查，B超探及孕囊存在为临床妊娠，孕囊数目为着床胚胎数目。对临床妊娠的患者电话随访至产后6周。

5. 观察指标：主要结局指标为活产率(活产周期数/总周期数×100%)；次要结局指标包括：HCG阳性率(HCG阳性周期数/总周期数×100%)，着床率(B超下妊娠囊数/移植胚胎数×100%)，临床妊娠率(临床妊娠周期数/总周期数×100%)，流产率(妊娠28周前流产周期数/临床妊娠周期数×100%)，异位妊娠率(异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%)。

三、统计学分析

结 果

一、患者基本资料及胚胎移植情况比较

LMWH组和对照组患者的年龄、不孕年限、不孕因素、体质量指数(BMI)、移植胚胎类型等比较均无显著性差异(P>0.05)。LMWH组的基础FSH和移植日子宫内膜厚度显著高于对照组，而基础窦卵泡计数(AFC)则显著低于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 两组患者基础资料及胚胎移植情况比较[(-±s)，n(%)]

续表

二、LMWH对妊娠结局的影响

两组患者的活产率比较无显著性差异(P>0.05)；LMWH组的HCG阳性率、着床率、临床妊娠率和流产率均显著高于对照组(P<0.01)；对照组有12个周期(1.31%)发生异位妊娠，LMWH组无异位妊娠发生，因样本数相差较大，未行统计学分析(表2)。多因素GEE回归分析发现，LMWH[OR=2.13，95%CI(1.40，3.22)]、年龄[OR=1.08，95%CI(1.03，1.12)]、不孕类型[OR=1.89，95%CI(1.36，2.63)]、移植胚胎数目[OR=0.56，95%CI(0.40，0.77)]和移植胚胎类型[OR=0.71，95%CI(0.58，0.87)]是流产率的独立影响因素(P<0.001)；年龄[OR=0.93，95%CI(0.91，0.95)]、移植日内膜厚度[OR=1.09，95%CI(1.02，1.17)]、不孕类型[OR=0.72，95%CI(0.59，0.88)]、移植胚胎数目[OR=1.76，95%CI(1.45，2.14)]、移植胚胎类型[OR=1.81，95%CI(1.59，2.07)]、移植胚胎质量[OR=0.75，95%CI(0.67，0.84)]是活产率的独立影响因素(P<0.01)(表3)。

表2 两组患者妊娠结局的比较(%)

三、PSM后LMWH对妊娠结局的影响

为减少两组样本量差异过大产生的偏倚，根据1∶2的比例进行PSM，匹配后所有变量的绝对标准均值差均小于0.1(图1)。匹配后LMWH组纳入182个解冻周期，对照组纳入364个解冻周期。PSM后两组患者的妊娠结局比较显示，两组的活产率仍无显著性差异(P>0.05)；LMWH组的HCG阳性率、着床率、临床妊娠率、流产率仍显著高于对照组(P<0.05)；结果与匹配前一致(表4)。

表3 两组患者流产率和活产率的GEE分析

图1 PSM前后协变量的绝对标准均值差变化

表4 PSM后两组患者妊娠结局的比较(%)

讨 论

本研究发现LMWH可显著提高患者的HCG阳性率、着床率、临床妊娠率和流产率(P<0.05)，但两组的活产率并无显著差异(P>0.05)，推测LMWH虽可以提高临床妊娠率，但因流产率也相应升高，故最终活产率并无显著差异。

LMWH对多次移植失败患者妊娠结局的影响目前还存在争议。一项随机开放性研究发现，≥2次移植失败的患者使用LMWH后的活产率比对照组高8%(n=150)，但没有统计学差异(P>0.05)[15]。Lodigiani等[16]的研究发现，≥2次移植失败的患者使用LMWH后的妊娠率显著高于对照组(P<0.05)，遗憾的是文中并没有把活产率作为结局指标。另一项随机对照研究(RCT)同样发现，使用LMWH后的RIF患者活产率、着床率和临床妊娠率显著升高，流产率显著降低(P<0.05)；但因该研究样本量较小(n=83)，且LMWH组仅1人流产，对照组仅2人流产，故流产率的组间差异可能存在一定的偏倚[17]。熊正方等[18]对RIF患者开展的研究也表明，使用LMWH可以增加临床妊娠率。Berker等[19]对207例≥2次移植失败患者进行的RCT研究并没有发现LMWH对患者的妊娠结局存在显著影响；但这一研究仅限于新鲜周期移植的患者，而多次移植失败的患者往往更倾向于解冻周期移植。另一项多中心回顾性队列研究的结果同样认为，使用LMWH并没有改善≥2次移植失败患者的妊娠结局[20]；但该研究未把活产率作为最终结局指标且未对相关混杂因素进行调整。此外，还有一些无移植失败史或仅移植失败1次的研究也显示，LMWH并不能改善移植患者的妊娠结局[21-22]。由于各个研究的异质性较大，用药人群、用药时间和方式等都不尽相同，因此，还需要更高等级的证据进一步探究LMWH对多次移植失败患者妊娠结局的影响。

目前关于LMWH影响妊娠的机制研究仍较少。Qublan等[5]发现，68.9%的3次及以上着床失败患者至少存在一项遗传或获得性血栓形成倾向的危险因素，而移植1次就成功妊娠的患者中这一概率仅为25.6%。对使用LMWH患者的子宫进行血流动力学检测发现，LMWH可以降低子宫动脉血流阻力，增加子宫灌注，从而营造有利于胚胎着床的子宫环境[23]。免疫调节在这一过程中也可能起重大作用[24]。有研究表明，LMWH可以改变RIF患者Th-1相关细胞因子的表达水平，调节免疫耐受[25]。此外，LMWH还可以与L-选择素、钙粘素、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、胰岛素样生长因子Ⅰ/Ⅱ(IGF-Ⅰ/Ⅱ)、白介素(IL)-1、IL-6、白血病抑制因子(LIF)、基质金属蛋白酶(MMP)等胚胎着床相关分子相互作用[4]，从而调控胚胎着床过程。LMWH影响着床及妊娠的具体机制目前尚不明确，血栓形成倾向、子宫血流灌注、免疫调节等均有可能在其中发挥作用，具体作用机制还需要更进一步的研究探讨。

本研究中LMWH组的流产率显著升高(P<0.05)，推测其原因是一些可能发生生化妊娠的胚胎在LMWH使用后虽然成功着床但并不能顺利发育。但该推测尚需要进一步的临床及机制研究加以证实。

本研究聚焦于LMWH使用对≥2次移植失败患者妊娠结局的影响，更贴近于临床上LMWH在多次移植失败患者中应用的情况。同时，本研究只纳入了用药超过1个月即具有良好依从性的患者，减少了患者不规律用药可能造成的偏倚；并且通过PSM及GEE对样本量和年龄、BMI等多个混杂因素进行调整，减少了多周期移植及相关混杂因素对结果造成的影响。

本研究为回顾性队列研究，仍然存在一些局限性：首先，本研究未对所有患者血栓前状态进行检测，血栓前状态及一些其他可能被忽略的潜在混杂因素可能影响妊娠结局；第二，本研究中两组样本量差异过大，可能会影响最终结果，因此按照1∶2的比例进行了PSM来减少样本量差异引起的偏倚；第三，本研究为单中心研究，结论的外推性还需要进一步确定；最后，本研究未对药物使用不良反应等情况进行随访记录，这可能对临床最终决策产生影响。

综上所述，LMWH可以提高≥2次胚胎移植失败患者的HCG阳性率、着床率、临床妊娠率及流产率，但活产率并未明显提高。LMWH对妊娠结局的影响还需要进一步的RCT加以证实。临床医生在应用LMWH来改善≥2次胚胎移植失败患者的妊娠结局时需要关注其增高流产率的风险。