卵母细胞敲除Rictor对纺锤体和早期胚胎发育的影响

刘红，成艳君，周永红，李雪梅

(南方医科大学附属深圳市妇幼保健院生殖中心，深圳 518017)

卵巢中原始卵泡池大小是女性和大多数哺乳动物生殖寿命的主要决定因素[1]。一般情况下，40岁以上女性原始卵泡池开始出现耗竭，进入卵巢衰竭或更年期。当剩余卵泡数量减少到阈值以下(<1 000个)时，卵泡的正常激活不再发生，发育卵泡停止募集，导致无排卵和闭经[2]。卵巢早衰(POF)是指女性40岁以前出现排卵和卵巢分泌激素功能紊乱和停止的疾病，严重危害女性的生育能力[2-3]。全世界约有1%的女性患有POF，诱因主要有自身免疫性卵巢损伤、染色体异常或某些特定基因的遗传异常[4]。虽然FMR1[5-7]、FMR2[7]、FOXL2[8]等基因被认为是导致POF的候选基因，但临床上大多数病例为特发性病因[9]，发病机制尚不明确，为POF的防治增加了难度。

Rictor蛋白由1 708个氨基酸组成，含约37个磷酸化位点，主要是位于C端区域的丝氨酸或苏氨酸残基[10-12]。Rictor可通过AKT依赖和不依赖的方式在细胞增殖、迁移和代谢中起重要作用，进而影响细胞功能[13-15]。研究发现，Rictor对小鼠的胚胎发育至关重要，Rictor缺失会导致小鼠胚胎期死亡[16]。Rictor在小鼠卵巢中分布广泛，参与卵母细胞减数分裂过程中肌动蛋白的不对称分裂，对卵母细胞的成熟起决定性作用[17]。然而尚未有研究阐明Rictor在卵泡形成中的作用机制。本课题组已成功构建卵母细胞条件性敲除Rictor基因小鼠模型，该小鼠可出现POF表型[18]，但Rictor如何诱导POF进而导致雌鼠生育能力下降的分子机制不明。因此，本研究拟通过探讨Rictor基因敲除对小鼠卵母细胞功能的影响，进一步阐明Rictor在卵母细胞发生和早期胚胎发育中的调控作用，为POF等相关疾病提供新的理论依据和潜在治疗靶点。

材料与方法

一、材料

1.小鼠的繁育与基因型鉴定[18]：本研究所需的Zp3-Cre小鼠(Jax编号003650)及Rictorloxp/loxp小鼠均由南方医科大学陈振国课题组馈赠。获得卵母细胞条件性敲除小鼠的实验简要概述如下：将雄性Zp3-Cre+小鼠与雌性Rictorloxp/loxp小鼠交配，得到Zp3-Cre+，Rictorloxp/WT雄性小鼠，再与Rictorloxp/loxp雌性小鼠回交，获得Zp3-Cre+，Rictorloxp/loxp雌性小鼠，即为条件性敲除(Rictor-cKO)小鼠(KO组)。取同窝Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌性小鼠作为对照组(WT组)。利用免疫组织化学染色验证敲除效果。在卵母细胞条件性敲除实验中，携带Cre转基因的雄性(而非雌性)被用于育种，以防止全身性敲除[19]。基因型鉴定的引物如下，Zp3-F：5’-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’，Zp3-R：5’-GTGAAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’；Rictor-F：5’-GAAGTTATTCAGATGGCCCAGC-3’，Rictor-R：5’-ACTGAATATGTTCATGGTTGTG-3’。所有动物实验均得到了南方医科大学动物使用和伦理委员会的批准，并按照该委员会的指导方针和规定进行。

2.主要试剂、耗材与仪器：M2培养基(M7167，Sigma，德国)；含10%血清替代品(SSS，Irvine公司，美国)的人胚胎卵裂培养基(ECM，Irvine公司，美国)；DAB显色液(中杉金桥)。人绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素(PMSG) 均购自宁波第二激素厂；Rictor 、a/β-Tubulin(2148S) 一抗均购自Cell Signaling Technology(美国)；荧光二抗(111-035-003)购自Jacksonimmuno(美国)。所用培养皿无特殊说明均购自美国康宁公司。Eppendorf Transferman显微操作系统(德国)；Olympus倒置显微镜(日本)。

二、方法

1.卵母细胞获取及形态评估：取4月龄的雌鼠腹腔注射PMSG(7.5 U/只)，48 h后注射HCG(10 U/只)，13.5 h后脱臼法处死小鼠，剪取输卵管。在体视镜下使用注射器针头划破输卵管壶腹部，挑出卵丘卵母细胞复合体(COCs)，用0.3 mol/L的透明质酸酶消化处理，即可获得卵母细胞。正常第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞形态鉴定标准：卵周间隙适中可见第一极体，透明带光滑无锯齿状等异常改变，胞质颗粒均匀无空泡。选取形态较好的卵母细胞转入人卵裂培养基中，置于37℃、5.8%CO2培养箱中孵育备用。

2.卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)[20]：应用显微操作系统，在M2液滴中进行显微注射。注射针吸入野生型雄鼠的精子头，使精子头位于注射针尖端，固定针固定卵母细胞，将第一极体置于12点或6点，注射针刺入卵母细胞胞质内，缓慢回吸后形成负压破膜，将精子头注射入卵母细胞胞质中心区域，稍作停顿退出注射针。注射后的卵母细胞置于人胚胎卵裂培养基中，37℃、5% CO2的培养箱内孵育观察。

3.卵母细胞减数分裂纺锤体状态和染色体排列的评价[21-22]：取透明质酸酶脱颗粒细胞处理后的卵母细胞，用酸性的M2培养基去除透明带并转移至含1%明胶的载玻片上，于含2%BSA、0.02% Triton-X 100的2%多聚甲醛中固定30 min，用含2%BSA的0.05% Triton-X 100破膜15 min，正常山羊血清37℃封闭1 h，PBS洗3次后加入含2% BSA与0.05% Triton-X 100的兔抗a/β-tubulin(1∶200)一抗，4℃过夜，PBS洗3次后加入含2% BSA与0.05% Triton-X 100的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。最后用10 μg/L DAPI避光孵育15 min，激光共聚焦显微镜下观察微管的分布及染色体的排列情况。当卵母细胞减数分裂纺锤体排列松散和/或染色体排列异常以及没有纺锤体和/或染色体时，定义为纺锤体或染色体异常。

4.观察指标：包括2PN(精卵原核融合时期)数量、2-细胞胚胎(受精卵第一次有丝分裂)数量和4-细胞胚胎(受精卵第二次有丝分裂)数量。2PN率=2PN数量/注射卵母细胞数×100%；2-细胞胚胎率=2-细胞胚胎数量/2PN数量×100%；4-细胞胚胎率=4-细胞胚胎数量/2-细胞胚胎数量×100%。

三、统计学分析

结 果

一、卵母细胞条件性敲除Rictor基因对小鼠排卵数量的影响

为研究条件性敲除Rictor对雌鼠排卵的影响，课题组成功繁育Zp3-Cre+，Rictorloxp/loxp小鼠(KO组)(图1A和图B)，以同窝Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌鼠为对照鼠(WT组)，通过注射促性腺激素，观察条件性敲除小鼠排出的卵母细胞的形态及排卵的数量。结果显示，KO组的平均排卵数为(14.84±2.64)个(n=6)，对照鼠(WT组)平均排卵数为(15.84±4.92)个(n=6)，差异无统计学意义(P>0.05)(图1C)；敲除鼠与对照鼠的卵母细胞畸形率亦无显著性差异(P>0.05)(图1D)；卵母细胞形态也未见明显异常(图1E)。

A：琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型；B：免疫组化验证敲除效果；C：WT和KO小鼠平均排卵数的比较；D：WT和KO小鼠卵母细胞畸形率的比较；E：WT和KO小鼠卵母细胞形态。

二、卵母细胞条件性敲除Rictor基因对雌鼠受精卵发育影响

为验证在卵母细胞中敲除Rictor对胚胎发育的影响，我们通过ICSI实验，将野生型雄鼠的精子头部注射到敲除鼠的卵母细胞内，以同窝Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌鼠为对照鼠(WT组)，观察受精卵的发育情况。结果显示，同时段内观察到的2PN率、发育到2-细胞期胚胎数量均显著低于对照组(P<0.05)，发育到4-细胞期胚胎数量亦减少(44.4%)，大部分胚胎仍处于2-细胞期卵裂阶段，且有少数受精卵发育停滞，未发生卵裂(图2、表1)。

图2 卵母细胞敲除Rictor对雌鼠受精卵发育影响

表1 敲除Rictor基因的雌鼠卵母细胞的发育情况(%)

三、卵母细胞条件性敲除Rictor对小鼠染色体的影响

为阐明卵母细胞条件性敲除Rictor后导致胚胎发育迟缓的原因，我们对卵母细胞进行免疫荧光化学染色，检测Rictor是否影响染色体数量及纺锤丝的形成。结果显示，卵母细胞条件性敲除Rictor后，卵母细胞的染色体数量正常，但部分卵母细胞的纺锤体形成异常，出现纺锤体排列异常、散乱分布等现象(图3A)；对照组(WT组)小鼠仅有少部分卵母细胞出现异常(11.57%)，敲除鼠卵母细胞纺锤丝异常错误率达到24.43%，差异有统计学意义(P<0.05)(图3B)。

A：WT(左)和KO(中、右)小鼠卵母细胞纺锤体微管的形态；B：WT和KO小鼠卵母细胞纺锤体微管畸形率的比较。与WT组比较，*P<0.05。

讨 论

女性的生殖寿命取决于卵巢原始卵泡池的大小，人类卵巢原始卵泡池的大小通常在胚胎发育期间确定。通过卵泡激活的过程将原始卵泡从休眠卵泡的储存库募集到生长卵泡池中，优势卵泡可发育成熟直至排卵，其余大量卵泡出现凋亡，形成闭锁卵泡[18]，当原始卵泡池耗竭时，会出现更年期或POF。因此卵泡生长发育对卵巢功能的维持起决定性作用，各种原因引起的卵泡发育受阻或过度耗竭则是导致POF的直接因素[23-24]。卵泡耗竭的发生早于POF症状的出现，这也严重阻碍了对于POF发生机制的基础研究。

课题组在前期构建的去氧乙烯基环己烯(VCD)诱导的POF小鼠模型和卵母细胞Rictor-cKO的小鼠模型中发现，Rictor在卵母细胞中对卵泡发育具有保护作用,接受抑制卵母细胞中的Rictor后，卵泡闭锁加速，卵泡丢失增多[18]。同时，Rictor-cKO小鼠表现出一种全新的POF卵巢表型，其卵泡池和血清雌激素水平均有相似的下降，生育能力在4月龄开始明显衰退、8月龄时完全不孕。已有研究显示，Rictor对小鼠的胚胎发育至关重要，Rictor缺失小鼠表现出胎盘功能缺陷和胚胎发育停滞[16，25]。但我们并未在Rictor-cKO小鼠中观察到相似的胎盘缺陷表型，同时课题组以往研究还显示，卵母细胞条件性敲除Rictor雌鼠卵泡形成基本正常。基于此，我们设想Rictor可能通过调控卵泡成熟及受精卵卵裂，从而影响胚胎发育的进程。然而本研究结果显示：与对照鼠相比，Rictor-cKO小鼠排出的卵母细胞形态无明显变化，排卵数量以及卵母细胞畸形率也无统计学差异。但是，卵母细胞条件性敲除Rictor会导致受精卵能力减弱，胚胎发育严重迟缓。因此，我们推测卵母细胞条件性敲除Rictor可能不影响卵母细胞的形态及数量，但可能对胚胎的正常发育有重要影响。

为深入研究Rictor调控卵母细胞发育的深层机制，阐明Rictor对胚胎早期发育的影响，本研究应用Rictor-cKO小鼠模型，通过对4月龄的雌鼠进行ICSI结合卵母细胞荧光化学染色，试图发现Rictor对小鼠早期胚胎发育的影响。研究结果显示，4月龄Rictor-cKO小鼠卵母细胞受精后胚胎发育出现严重滞后甚至停滞的现象；同时，免疫荧光染色结果显示，Rictor-cKO部分卵母细胞的纺锤体排列异常率明显升高。由此，我们认为卵母细胞条件性敲除Rictor可能会导致卵母细胞的纺锤丝形成异常，进而导致胚胎发育出现停滞或者滞后的现象。但Rictor可能不是导致纺锤丝形成异常的直接因素，Rictor如何影响纺锤丝的组装机制有待进一步阐明。本研究结果具有广泛的生理和临床意义，有助于进一步探讨Rictor在调控正常卵巢生理功能中的作用，可能为POF的防治带来新的理论依据。我们随后的研究将重点关注Rictor调控正常卵母细胞纺锤丝的形成及诱导早期胚胎发育的分子机制。生理性妊娠过程中，精细的母-胎对话对妊娠成功维持是不可或缺的，胚胎在早期发育时如能在精准时段内向母体发出信号并获得反应，胚胎才能存活并种植到子宫[26]。目前的研究尚未揭示Rictor是否在母-胎之间的对话中起到积极性的作用。

综上所述，Rictor对卵母细胞减数分裂过程中纺锤丝的装配及维持早期胚胎正常发育具有关键作用。卵母细胞条件性敲除Rictor引起纺锤丝的排列异常，进而影响胚胎的早期发育。这为我们后续探讨Rictor调控卵母细胞形成及胚胎发育的分子机制提供了新依据，也为POF的防治提供了新的理论基础和潜在治疗靶点。