宫颈微生物菌群对IVF-ET妊娠结局的影响

崔媛媛，叶德盛，郑炜炜，谭颖，马从顺，詹雪君，宋革*

(1.广东省生殖医院生殖医学中心，广州 510600；2.广东省生殖科学研究所，广州 510600；3.国家卫生健康委男性生殖与遗传重点实验室，广州 510600；4.广州市妇女儿童医疗中心生殖医学中心，广州 510623)

自1978年世界上第1例试管婴儿出生，辅助生殖技术(ART)尤其是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术已成为治疗不孕症的有效手段。垂体降调节药物使促排卵更高效，胚胎玻璃化冷冻技术大大提升胚胎利用率，临床妊娠率逐步提高。但事实上，由于胚胎的种植机制仍不明确，即便经过遗传学筛查胚胎着床率仍较低，孕早期流产率和早产率较高，反复着床失败患者缺乏有效的临床治疗手段[1]。因此，改善子宫内膜容受性及妊娠结局，成为ART发展的瓶颈。近年研究发现，生殖系统微生物组异常不仅导致生殖道感染和女性不孕症[2-3]，还与胚胎移植后的妊娠结局有关[4-6]，是改善IVF预后的新突破口。

随着基因测序技术的发展，借助高通量测序技术对可变区进行测序，结合生物信息学分析，可全面了解机体内的菌群多样性，同时了解菌群质和量的变化与疾病发生发展的关系，也为了解未知菌属在疾病中的作用开辟了新的研究方法。本文通过高通量测序技术，研究新鲜取卵周期移植日宫颈微生态菌群对IVF妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

选择2020年3—9月在广东省生殖医院生殖医学中心行IVF/ICSI新鲜周期胚胎移植的患者为研究对象，提取其宫颈分泌物作菌群检测。

纳入标准：(1)年龄<35岁；(2)卵泡刺激素(FSH)<10 U/L且抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml；(3)可用胚胎>2个；(4)宫腔镜检查排除子宫内膜炎；(5)移植术前3个月内行宫颈黏液检查，排除衣原体、淋病奈瑟菌感染；一周内行阴道分泌物检查，排除阴道特异性及非特异性炎症；无阴道瘙痒、白带增多等自觉症状；(6)取样前1个月内未使用抗生素；取样3 d内未行阴道冲洗，无性生活。

排除标准：(1)女方急慢性宫颈炎；(2)子宫畸形、宫腔粘连、子宫黏膜下肌瘤、子宫内膜息肉、子宫腺肌症、子宫内膜异位症、输卵管积水；(3)合并抗磷脂综合征、甲状腺功能异常、糖尿病等严重系统性疾病；(4)有复发性流产、反复着床失败病史。

所有研究对象均签署书面知情同意书。本研究已获得广东省生殖医院医学伦理委员会批准(伦理审查号：论审研第[2019](25)号)。

本研究共收取标本33例，其中活产17例，生化妊娠1例，流产2例，未孕13例，选取活产及未孕患者共30例进行分析。

二、研究方法

1.IVF/ICSI-ET治疗：采用长方案或拮抗剂方案，常规剂量启动(150～300 U)，定期监测排卵，根据卵泡生长情况及激素水平适当调整促排药物剂量。当1个卵泡直径≥18 mm或3个卵泡直径≥17 mm 时，注射重组人绒毛膜促性腺激素(HCG，艾泽，默克雪兰诺，德国)或/和GnRH-a(达菲林，博福-益普生，法国)扳机，36～37 h后取卵。取卵后予黄体酮(浙江仙琚) 60 mg/d 肌肉注射黄体支持，3～5 d后行胚胎移植。移植后予地屈孕酮(达芙通，雅培，荷兰) 30 mg/d + 黄体酮凝胶(雪诺同，默克雪兰诺，德国) 90 mg/d 黄体支持。移植后12 d抽血查β-HCG，生化妊娠者(HCG>5 U/L)继续黄体支持。移植28 d后行阴道B超检查可见宫内孕囊确定为临床妊娠，临床妊娠者黄体支持至孕10～11周。按常规流程进行随访。

2.标本采集：患者均于胚胎移植手术时留取宫颈管分泌物标本。清洁外阴，消毒铺巾，窥阴器撑开阴道，无菌棉球擦拭宫颈表面，用干燥无菌棉签插入宫颈管内转动10圈，待棉签吸取分泌物后，取出棉签放入干燥无菌管，折断尾部。取样过程中，棉签避免接触阴道口及阴道壁，以防发生标本污染。所有研究对象的取样和移植均为同一操作者。

3.宫颈微生物菌群的检测：(1)宫颈细菌总DNA提取：采用PowerSoilDNA分离试剂盒提取宫颈棉签上的细菌总DNA，分离出的总DNA含量通过PicoGreen DNAassay(Invitrogen)进行定量检测，并按纯化试剂盒说明进行纯化；(2)16S rRNA基因高可变区V3-V4高通量测序：使用PCR引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对总DNA中的16S rRNA V3-V4区域进行PCR扩增(TransStartFastPfu DNA Polymerase)，并使用Illumina MiSeq平台进行测序；(3)生物信息学分析：使用QIIME进行生物信息学分析。根据OTU分类鉴定结果，获得样本在界、门、纲、目、科、属、种水平的具体组成和丰度。后续分析包括聚类分析、Alpha多样性、Beta多样性分析、显著性差异分析、线性判别分析及相关性热图。

三、统计学分析

结 果

一、患者基本情况比较

本研究共纳入患者30例，其中未孕组13例，活产组17例。两组患者年龄、不孕年限、BMI、基础FSH、窦卵泡数(AFC)、原发不孕比例及不孕因素差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者基本情况比较[(-±s)，n(%)]

二、患者促排卵及胚胎发育情况比较

两组患者促排卵方案、受精方式、平均Gn用量、HCG日P水平、HCG日内膜厚度、获卵数、可用胚胎数、优胚数、移植胚胎数及移植优胚数比较均无统计学差异(P>0.05)，活产组Gn天数及HCG日E2水平均显著高于未孕组(P<0.05)(表2)。

表2 两组患者促排卵及胚胎发育情况比较[(-±s)，n(%)]

三、两组患者的宫颈微生物组成

1.菌群多样性分析：两组样本共检测出有效序列数2 349 161条。以序列数与物种数或多样性指数构建稀释曲线。Alpha多样性是对样品中物种多样性的分析，包含物种的丰富度和均匀度两个方面。其中，Chao1估计菌落中包含物种的数目；Good’s_coverage代表微生物覆盖率；Shannon指数表示物种多样性。各个标本多样性物种含量经秩和检验，两组宫颈菌群在物种丰富度和均匀度方面比较均无统计学差异(图1 A～F)。

采用Beta多样性对两组生物多样性进行比较。Beta多样性指不同群落之间的物种差异，通过计算样品间的距离矩阵，观察样本间差异。本文采用PCA主成分分析观察样本之间的差异，数据显示两组患者宫颈微生物菌群组成成分有统计学差异(P=0.002)；通过UPGMA层次聚类分析，直观显示不同组中的微生物进化的差异程度较小(P=0.1)(图1 G～H)。

A：Chao1指数稀释曲线；B：Chao1指数小提琴图；C：Goods_coverage稀释曲线；D：Goods_coverage指数小提琴图；E：Shannon指数稀释曲线；F：Shannon指数小提琴图；G：Beta多样性PCA分析；H：UPGMA层次聚类分析。N：未孕组；P：活产组。

2.两组物种丰度聚类分析及组间菌群门、科、属、种水平差异：根据feature结果和各样品feature特征表，获得界、门、纲、目、科、属、种水平物种丰度表，并对两组间物种组成及差异进行分析。选取丰度最高的30个物种分类，将每组在门、属的相对丰度以气泡图形式展现。采用热图展示两组在门-科-属-种水平上菌群结构不同(图2)。

菌门水平，共检测到25种，相对丰度在1%以上共4种，为厚壁门、变形杆菌门、放线菌门、拟杆菌，占宫颈样本微生物总数的90%以上。

科水平，活产组相对丰度最多的为乳杆菌科(67.34%)、双歧杆菌科(9.99%)、莫拉菌科(2.94%)；未孕组丰度最多的为乳杆菌科(58.40%)、双歧杆菌科(9.26%)、假单胞菌科(4.64%)，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

属水平，活产组相对丰度最多的为乳杆菌属(67.33%)、加德纳菌属(9.90%)、不动细菌属(2.76%)；未孕组相对丰度最多的为乳杆菌属(58.40%)、加德纳菌属(8.84%)、假单胞菌属(4.64%)、大肠杆菌志贺氏菌属(2.76%)。两组患者主导菌群均为厚壁门乳杆菌属，活产组乳杆菌属丰度较高，但两组差异无统计学意义(P>0.05)。

种水平，两组主导菌群差异显著。活产组丰度最高的分别为卷曲乳杆菌(43.71%)、惰性乳杆菌(13.90%)、阴道加德纳菌(6.81%)、詹氏乳杆菌(3.55%)、未培养的乳杆菌(3.19%)；未孕组为惰性乳杆菌(50.29%)、阴道加德纳菌(6.90%)、卷曲乳杆菌(3.86%)、假单胞菌(3.37%)、未分类的志贺氏菌(2.83%)。两组比较，卷曲乳杆菌和惰性乳杆菌相对丰度差异有统计学意义(P<0.05)。

采用线性判别分析(LEfSe)方法对两组患者宫颈微生物群进行分析，共发现7个生物标记物，包括属水平2个，种水平5个。其中，活产组生物标记物主要有种水平的卷曲乳酸杆菌和奥尔塞内拉菌，未孕组生物标记物有胃瘤球菌属、理研菌属，种水平有惰性乳杆菌、未识别的胃瘤球菌、里肯内拉菌及未识别的里肯内拉菌。

3.环境因素相关性分析：为研究环境因素与宫颈微生物群的影响，采用Spearman秩相关系数分析各组不孕类型、年龄、AFC、基础FSH、促排卵方案、HCG日E2水平、Gn天数等环境因素对胚胎移植日宫颈菌群属、种相对丰度最多的10种菌群的关系。结果显示，属水平，乳杆菌属相对丰度与各环境因素无相关性，韦荣球菌属和链球菌属相对丰度与促排卵天数正相关(P<0.05)；种水平，优势菌群惰性乳杆菌与促排卵天数负相关(P<0.05)，未培养的乳杆菌与BMI负相关(P<0.05)。其他非优势菌群中，AY-2011-RS11假单胞菌与促排卵方案相关(P<0.01)；HCG日雌激素水平与属、种水平丰度前十位菌群均无相关性(图3)。

A：两组菌群气泡图；B：两组门水平热图分析；C：两组科水平热图分析；D：两组属水平热图分析；E：两组种水平聚类分析；F：种水平主要菌群詹氏卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌两组的相对丰度；G：两组经线性判别分析(LEfSe)有显著性差异的物种。N：未孕组；P：活产组

A：环境因素与宫颈微生物群属水平相对丰度前10位菌群相关性热图；B：环境因素与宫颈微生物群种水平相对丰度前10位菌群相关性热图。

讨 论

人体不同部位的菌群(例如肠道/呼吸道/皮肤及阴道等)与多种疾病的发生发展密切相关[7]，现已成为新的研究热点。生殖系统的微生物约占人体总菌群的9%。女性正常阴道菌群中，以不同类型的乳酸杆菌为主，还寄生了双歧杆菌、拟杆菌、肠球菌、链球菌、加德纳菌等多种细菌，以及支原体、假丝酵母菌等，它们相关制约、相互作用，共同构成阴道微生态环境[8]。同时，阴道微生物随月经周期变化而改变，在排卵期和黄体中期丰度最高[9]。生殖系统的微生态平衡对女性生育能力影响显著，菌群紊乱引起生殖系统的炎症，不仅可能导致不孕[2]，还与子宫内膜容受性、早期妊娠维持、早产等有关[5，10-11]。

绝大多数学者认为，测序技术发现的阴道-宫颈及子宫内膜的微生物菌群异常对胚胎移植的妊娠结局产生不可忽视的影响[12]。阴道主要菌群为非乳杆菌更容易出现反复着床失败、子宫内膜炎及复发性流产。付敏等[6]留取移植日阴道分泌物，发现不明原因反复着床失败患者阴道微生物多样性增加，表现为乳杆菌丰度降低，而阴道乳酸杆菌占主导者具有较高的临床妊娠率。Moreno等[4]采用基因芯片测定内膜容受期宫腔内菌群进行分析，发现在容受期内膜菌群高度稳定，乳酸杆菌为优势菌群组有更好的临床妊娠结局。

对于一般人群，生殖道微生物群分析能否预测IVF/ICSI-ET妊娠结局，目前尚存有争议。2012年Hyman等[13]将高通量测序技术用于IVF周期内患者阴道菌群检测，发现移植日阴道菌群会影响IVF妊娠结局。2017年Franasiak团队[14]发现，移植管尖端乳酸杆菌占优势的患者临床妊娠结局并没有出现显著性增高。目前大部分文献报道以阴道取样标本为主，但从胚胎移植手术的操作流程考虑，宫颈内菌群在移植过程中会被直接带入宫腔。因此，本研究选择年轻(<35岁)、可用胚胎>2个、无反复种植失败病史的预后良好患者作为研究对象，分析其宫颈微生物菌群与临床妊娠结局的相关性。研究结果显示，活产组与未孕组在门、属水平均以乳杆菌为优势菌群，其中活产组的属水平乳杆菌相对丰度较高，但两组差异无统计学意义(P>0.05)；未孕组患者在胃瘤球菌属、理研菌属等异常菌群显著增加，这与Chen等[15]研究结果相似。Chen等[15]研究发现，在IVF/ICSI治疗过程中，妊娠组和未孕组厚壁门、乳杆菌属等优势菌群差异无统计学意义，乳杆菌属在患有子宫内膜炎妊娠组和未孕组比较仍无差异；菌群异常主要体现在非优势菌群，如放线菌属、酸杆菌属等。以上研究均提示，在一般人群，乳酸菌属优势菌群并不是正常生殖道微生物群和良好妊娠结局的保障。

在种水平，本研究结果证实，一般人群中乳杆菌在种水平上的变化对妊娠有一定的预测作用。活产组以卷曲乳杆菌为主要生物标记，未孕组则以惰性乳杆菌为主要生物标记，两组差异有统计学意义(P<0.05)。荷兰学者在303例接受IVF/ICSI治疗的女性阴道菌群研究中得出相同的结论，该研究结果显示，卷曲乳杆菌为优势菌群是预测妊娠的重要指标[16]。在生育期，高水平的雌激素和孕激素维持乳酸杆菌在阴道内占优势：雌激素使阴道上皮细胞内糖原蓄积，孕激素促进上皮细胞脱落，释放糖原。乳酸杆菌将糖原分解为乳酸，维持正常阴道内酸性环境，抑制其他细菌繁殖。然而，不同乳杆菌的作用完全不同。卷曲乳杆菌可抑制多种阴道致病菌的黏附和增殖，在健康女性阴道中相对丰度高，卷曲乳杆菌的缺失与菌群失调有密切关系[17]。研究表明，卷曲乳杆菌基因序列中包含了抑制阴道加德纳菌的蛋白基因，并且可以产生抑菌物质抑制白色假丝酵母菌生长以及菌丝形成[18]。而惰性乳杆菌很少与其他乳杆菌共存，容易被细菌取代，在阴道菌群失衡后大量繁殖而成为优势菌群。大多数研究认为，惰性乳杆菌的增多与亚健康状态有关，惰性乳杆菌为优势菌增加了患细菌性阴道病及衣原体的易感性[3，17-19]。异常菌群的存在可能通过宫腔炎性反应及影响内膜容受性等方式影响胚胎着床[20]。

本研究中，两组患者在促排卵天数及HCG日E2水平上有显著差异，而相关性分析表明环境因素对属水平上的优势菌群无明显相关性。2008年Jakobsson等[20]首次用16s RNA测序法研究降调周期促排卵期间阴道菌群变化，结果显示阴道优势菌群保持相对稳定，仅少部分菌群在促排卵过程发生变化。Zhao等[21]研究发现，不孕女性在促排卵前后阴道菌群无显著变化。以上结果提示生殖道菌群在个体中保持相对稳定性，促排卵前菌群测定对预测IVF/ICSI治疗结局仍有意义[16]。在种水平上，促排卵天数与惰性乳杆菌有相关性。既往研究表明，促排卵天数对妊娠结局无影响[22]，由于本研究样本量较小，仍需进一步扩大样本量分析环境因素对惰性乳杆菌种相对丰度的影响。

综上，本文首次采用16s rRNA测序方法研究新鲜周期胚胎移植日宫颈微生态，针对预后良好的一般患者展开研究。研究表明，宫颈菌群中优势菌群多为厚壁属乳杆菌，活产组与未孕组在菌群丰富度及均匀度上无显著差异，但在物种分布上有显著差异。卷曲乳杆菌为优势菌群可能是预测分娩的重要指标，而惰性杆菌为优势菌群则与着床失败有关，其可能原因为菌群失调导致的免疫紊乱。由于本文关注的为预后良好人群，且研究样本量有限，因此宫颈菌群是否影响新鲜周期胚胎移植妊娠结局尚需扩大样本量进一步研究。本研究结论不适用于特殊人群，或者冻融胚胎移植周期。