纳豆及纳豆芽孢杆菌研究进展

杨艳莉，吴雪玲，余知和*

(1.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025；2.湖北省荆州中学，湖北 荆州 434021)

纳豆是以大豆为原料，煮熟后接种纳豆芽孢杆菌发酵而成。成品纳豆表面呈金黄色，并覆有一层黏性物质，口感软烂，用筷子挑起后可出现长长的拉丝。与生大豆和蒸煮大豆相比，纳豆含有丰富的营养物质，如蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸等，且易被人体吸收。此外，纳豆具有多种生理功能，如溶解血栓、降低胆固醇、抗菌消炎、降血压、延缓衰老、调节肠道、预防骨质疏松症等[1]。纳豆芽孢杆菌是一类好氧型、有纤溶能力的杆状细菌，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，应用前景广泛[2]。本文简述了纳豆的起源和营养保健作用，以及纳豆芽孢杆菌的菌株筛选、多样性及应用等，为纳豆生产优化、纳豆芽孢杆菌菌株改良、推进纳豆产业的发展提供了新思路。

1 纳豆起源与制作

大豆作为良好的蛋白质和脂肪酸来源，在中国有着悠久的食用历史。发酵工艺使大豆的营养物质得到了更好的利用，常见的发酵豆制品有豆豉、豆酱、酱油、腐乳等。豆豉可分为细菌型豆豉和真菌型豆豉，前者包括日本纳豆、韩国清麴酱(Chungkukjang)[3]、泰国Thua-nao[4]、印度Kinema[5]等，真菌型豆豉则包括毛霉型、曲霉型、根霉型和脉孢菌型等，如印度尼西亚Tempe[6]。

纳豆源于日本平安时代僧人的饭食，因当时的日本寺庙称作“纳所”，故僧人所食豆制品称为“纳豆”。有学者认为，纳豆是中国的豆豉从云南传入日本后演变而成。纳豆的传统制作方法是利用干稻草趁热掩埋煮熟的大豆，借助稻草上的枯草芽孢杆菌，在40 ℃下发酵1～2 d即可。后工业化生产则是直接在煮熟大豆中接入纳豆芽孢杆菌。研究表明，纳豆的品质受大豆品种、发酵温度及时间、菌种及接种量等的影响[7-8]。

2 纳豆营养与保健

纳豆是粗蛋白和粗脂肪较为丰富的植物性食品，除含61.8%水分外，其主要成分为粗蛋白19.26%、粗脂肪8.17%、碳水化合物6.09%、粗纤维2.2%、灰分1.86%等，含有多种人体必需氨基酸及有益活性物质，赋予纳豆营养及保健作用。

2.1 纳豆激酶预防心脑血管疾病

1987年，Sumi等从纳豆中发现了一种能溶解血栓的纤溶酶——纳豆激酶(nattokinase，NK)[9]，其溶解血栓的速度是尿激酶的19倍。该酶是纳豆芽孢杆菌分泌表达的碱性丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽，具有纤维蛋白溶解活性[10]，其溶栓机理为直接有效地降解纤维蛋白；刺激血管内皮细胞产生t-PA，增加纤溶酶的形成；抑制纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)活性，使t-PA增加，促使血栓溶解；将尿激酶原转化为尿激酶，促进血栓溶解剂的产生[11]。其活性主要受3个方面的影响：物理方面包括温度、干燥处理及包埋方式等，化学方面包括pH、金属离子等，生物因素包括基因突变、菌种发酵等[12]。Lampe等[13]通过细菌回复突变、染色体畸变、急性毒性、临床试验等一系列毒理学评价，证明纳豆激酶易被人体吸收,持续作用时间长,无不良副作用，且在肠道中稳定性强，可直接口服。此外，纳豆激酶可预防和治疗阿尔茨海默症和玻璃体视网膜疾病等[14]。

2.2 维生素K2防治骨质疏松

维生素K2是一种脂溶性维生素，作为γ-羧化酶的辅助因子可维持骨骼强度，预防骨质疏松。纳豆在发酵过程中产生维生素K2，且98%为甲萘醌-7(MK-7)，是一种能预防骨质疏松的保健食品。Wang等[15]通过检测纳豆芽孢杆菌生长过程中氧化还原电位的变化，发现充足的氧气供应和良好的细胞膜状态有利于维生素K2合成，提高氧化还原电位，增加维生素K2产量，并能获得不含纳豆激酶的纯维生素K2。添加营养物质和表面活性剂可促进维生素K2的产生，并且非离子表面活性剂的影响大于离子表面活性剂[16]。

2.3 黏液素和维生素B2减少脂肪堆积

黏液素和维生素B2在人体肠道中分别阻止脂肪吸收和促进脂肪消耗。纳豆发酵产物γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一种特殊的阴离子聚酰胺，又称纳豆胶，由D-谷氨酸或L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基之间的酰胺键结合而成，是黏液素的组成物质。γ-聚谷氨酸及其衍生物具有溶于水，对人体无毒，可生物降解等环境友好特点，在食品、医疗和废水处理等方面广泛应用。目前，γ-聚谷氨酸制备主要是通过非谷氨酸依赖型的枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌等发酵，合成途径包括外消旋、聚合、调节和降解4个阶段[17]。研究表明，纳豆芽孢杆菌的代谢产物纳豆激酶抑制γ-PGA的产生。Wang等[18]为探讨纳豆激酶对γ-PGA产量的影响，在培养基中添加外源性活性纳豆激酶和灭活纳豆激酶，以添加蒸馏水作为对照，结果表明，活性纳豆激酶和灭活纳豆激酶均与γ-PGA合成呈正相关的显著抑制，而且活性纳豆激酶的抑制性更强，SDS-PAGE分析纳豆激酶水解γ-PGA产物结果显示，γ-PGA分子被纳豆激酶切割成许多碎片，推断纳豆激酶可能是通过酶催化水解来降低γ-PGA产量，为如何提高γ-PGA产率提供了方向。此外，经常食用纳豆能调节人体内巨噬细胞凋亡抑制因子(AIM)含量，溶解体内脂肪细胞，减少脂肪堆积。

2.4 其他

除上述营养与保健作用外，纳豆中的许多物质会对人体产生积极影响，如酵素可清除体内部分胆固醇，分解酸化型脂质，降低血压；多胺、染料木素、胰蛋白酶抑制剂有抗癌作用；卵磷脂、维生素、亚油酸等不饱和脂肪酸可减少过氧化物产生，改善皮肤，延缓衰老；蛋白酶和纤维酶能促进蛋白质降解，提高蛋白质消化率；大豆异黄酮又称“植物雌激素”，可调节激素水平，治疗更年期综合症。

3 纳豆芽孢杆菌

3.1 生物学特性

纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)俗称纳豆菌，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[19]，大小为0.7～0.8 μm× 2.0～3.0 μm，具有鞭毛，能运动，好氧，革兰氏阳性菌，能在5～55 ℃生长，最适生长温度为37 ℃，最适pH为7.0，耐盐，有一定耐高温能力，生长规律符合一般细菌生长规律[20]。菌落呈圆形或不规则形，表面粗糙，边缘不光滑，有褶皱，无光泽，呈灰白色或微黄色，中央颜色较深，有黏液。在不适环境下可产生内生抗逆孢子，芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏中生，孢囊膨大后不显著[21]。Nishito等[22]对纳豆芽孢杆菌BEST 195通过Illumina测序和基因组组装，获得染色体全长4091591 bp，G+C含量43.74%，蛋白质编码基因4375个，rRNA基因10个，tRNA基因93个，表明其与枯草杆菌家族第一个测序的实验室标准菌株Marburg 168[23]的亲缘关系密切。Kamada等[24]使用第三代高通量测序(PacBio RS)对纳豆芽孢杆菌BEST 195重新测序，得到了4105380 bp的完整基因组，发现了B.subtilisMarburg 168的同源基因和转座子编码基因330个。

3.2 菌株多样性

纳豆芽孢杆菌菌株分离通常采用平板稀释法，依据生理生化特性和分子性状鉴定。生理生化特性包括革兰氏染色、甲基红实验、过氧化氢酶实验、淀粉水解和明胶液化等。分子鉴定借助细菌16S通用引物进行PCR扩增，通过16S rDNA基因序列同源性分析，确定亲缘菌株。

传统发酵纳豆一般是借助于自然界的微生物，但不同地域及制作工艺的差别都会使微生物多样性存在差异，从而对纳豆质量与风味产生不同的影响。传统的可培养分离方法分析纳豆芽孢杆菌费时费力，且在实验室环境下，只有1%的微生物容易培养[25]。应用生理生化和分子生物学的方法包括Biolog法、脂肪酸甲酯(FAME)分析法、磷脂脂肪酸(PLFA)分析法，基于聚合酶链式反应(PCR)的变性/温度梯度凝胶电泳技术(DGGE/TGGE)、单链构象多态性技术(SSCP)、扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)、末端限制片段长度多态性技术(T-RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)技术、高通量测序(high-throughput sequencing)等，以及基于分子杂交技术的荧光原位杂交技术、分子标记法等[26-27]，研究纳豆芽孢杆菌多样性及群落结构动态变化，可进一步优化发酵条件，改善纳豆品质，提高纳豆产量。目前，已有关于中国豆豉微生物多样性的研究，但多为真菌型豆豉[28-29]。

3.3 菌株筛选

纳豆芽孢杆菌菌株通常是根据其生理生化特性如产蛋白酶、纤溶酶和维生素K2等来进行筛选，测定不同菌株在生长发酵过程中产生的酶活性或者其他代谢产物产量确定优势菌株[30]。为筛选符合目标条件的纳豆芽孢杆菌，常采用诱变方式筛选突变菌株。诱变筛选因诱变剂不同分为物理诱变、化学诱变及复合诱变。

Mohanasrinivasan等[31]利用改良的Holmstorm法测定纳豆激酶活性，然后对产酶菌株SFN01进行紫外诱变，结果发现突变菌株表现出更高的凝块溶解活性。Parks等[32]对产维生素K2菌株进行NTG诱变，得到的突变菌株(B.subtilisnattoVK161)产维生素K2最高水平为120 mg/L。该菌株基因组大小为4073396 bp，具有4332个编码基因 (63.9%具有预测的功能)、23个rRNA基因、77个tRNA基因，G+C平均含量为43.33%。常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma， ARTP)诱变技术是一项在微生物育种方面有诸多优势的新型诱变技术，可增强微生物的抑菌性、抗药性和对有毒物质的耐受性，尤其适合于产芽孢细菌的改良。孙博等[33]以纳豆芽孢杆菌BSN 424为出发菌株，经ARTP诱变筛选，得到一株富硒纳豆芽孢杆菌BN-44，为益生菌作为富硒载体提供了支持。

单一诱变剂对微生物基因的作用点和作用效果单一。由于微生物基因修复机制复杂，在微生物育种实践中常使用复合诱变来弥补单一诱变不足。常晓川等[34]以纳豆芽孢杆菌BN-3为出发菌，将经过紫外诱变的菌悬液涂布于硫酸二乙酯的BDP培养基平板上进行复合诱变，通过琼脂块法筛选得到突变菌株XC-80，并优化其发酵条件使突变菌达到最高抑菌活性。

4 应用

4.1 微生态制剂

微生态制剂是指能促进正常微生物群生长繁殖和抑制致病菌生长繁殖的制剂，因其成本低、环境友好、效果显著等，目前广泛应用于农业、医药保健和食品等领域。微生态制剂按物质组成可分为益生菌、益生元和合生元，纳豆芽孢杆菌属于益生菌类。纳豆芽孢杆菌制成的微生态制剂稳定性强，能通过拮抗与生物夺氧，调整菌群，维持微生态平衡。于雷等[35]研究芽孢杆菌微生态制剂对鸡产蛋性能及蛋品质的影响时，添加饲喂纳豆芽孢杆菌的鸡产蛋率和蛋品质明显高于其他芽孢杆菌。

4.2 天然防腐剂和抗菌剂

天然防腐剂是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用的物质，经人工提取或者加工而成为食品防腐剂，安全稳定。常用的防腐剂有山梨酸和尼泊金酯等，能有效干扰微生物酶类活性，但副作用高，对人体会造成一定损害。因此，开发天然防腐剂是亟待解决的问题。纳豆芽孢杆菌的抗菌蛋白能对食品起到一定的防腐作用，同时提升食品的口感及品质，被视为一类具有广阔应用前景的天然食品防腐剂。

纳豆芽孢杆菌能产生杆菌肽、多黏菌素、2,6-吡啶二羧酸和其他抗生素等次生代谢物，可抑制鼠伤寒沙门氏菌、痢疾菌、大肠杆菌等病原体作用，且具有热、酸碱稳定性，作用范围广。Osawa等[36]将葡萄球菌肠毒素A(SEA)污染的米饭与纳豆混合，在37 ℃下孵育1 h，反向被动胶乳凝集试验结果表明，纳豆芽孢杆菌产生的枯草杆菌蛋白酶可将SEA的蛋白分子裂解成小肽，降低抗SEA效价，且对其他类型的葡萄球菌肠毒素同样有效。

4.3 功能性食品

作为益生菌，纳豆芽孢杆菌被用于各种功能性食品开发。例如，利用纳豆芽孢杆菌固态发酵小米糠[37]、板栗[38]及银杏种子[39]等，使小米糠可溶性膳食纤维含量从2.3%提高到13.2%，可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维比例从3.1%提高到19.9%，板栗及银杏种子的总黄酮等含量增加，提高了板栗和银杏种子的纤溶活性和抗氧化活性，降低了银杏酸含量。Nie等[40]以豆浆和牛奶作为底物，利用纳豆芽孢杆菌在35 ℃、160 r/min培养24 h，添加其他添加剂后制成高纳豆激酶活性的混合乳，作为血栓治疗的食疗途径。除上述功能性食品外，可食性薄膜中的低聚果糖、冰淇淋功能性成分等都得益于纳豆芽孢杆菌发酵。

4.4 饲料添加剂

纳豆芽孢杆菌产生的细菌素等抗菌物质，能提高动物的免疫力，改善肠道菌群，促进动物肠道消化，分解饲料中的蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质，增进营养吸收，改善动物的外观表象和健康状态。另一方面，因其芽孢极强的抗逆性，在饲料加工过程中能耐受高温、挤压、无机盐、酸化剂等，因此在动物的饲料与养殖中成为最常用的益生菌之一[41]。如在绵羊饲喂过程中，纳豆芽孢杆菌能显著提高绵羊的蛋白质表观消化率和日增重，降低血清尿素氮含量，复合添加枯草芽孢杆菌效果更佳[42]；通过改变瘤胃发酵方式，纳豆芽孢杆菌能有效改善泌乳早期奶牛的泌乳性能，且对血液代谢产物无不良影响[43]。

4.5 其他

纳豆芽孢杆菌还可用于酶活性增强剂、免疫增强剂和水质改良剂等。纳豆芽孢杆菌能分泌出各种促进营养物质消化吸收的酶类，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶、纤维素酶和脲酶等；在肠道中纳豆芽孢杆菌能调节肠道菌群平衡，刺激机体产生免疫物质，提高机体免疫力；与不同菌种相互作用分解水中的废弃有机化合物、亚硝酸盐、氨盐、H2S等有害物质，改善水体氧气环境，提高溶氧量，给水生生物提供一个良好的生存环境并提供充足的养分[44]。

5 结语与展望

纳豆作为一种天然保健食品，不仅营养全面，还能预防心脑血管疾病和骨质疏松等常见病，因而受到众多关注。纳豆芽孢杆菌作为益生菌，在医药、食品、农业等领域展现出了巨大潜力，其代谢产物充分满足了人体的各种需要，通过多种诱变方式筛选得到的突变菌株也都具有稳定的高产性能。目前纳豆发酵常采用传统固态发酵，效率低且易污染，发酵菌株单一，产品的质量取决于发酵过程中的微生物及发酵条件。因此，研究纳豆微生物的多样性，筛选优势菌株，优化培养条件，从分子水平解析纳豆芽孢杆菌菌株的基因组结构与功能，开发专属发酵剂等将是未来有待探索的问题。