蜈蚣草的解剖结构与组织化学特征

李 腾 周存宇* 杨朝东 刘占峰

（1. 长江大学园艺园林学院，荆州 434025；2. 中国科学院海岛与海岸带生态恢复重点实验室/中国科学院华南植物园，广州 510650）

蜈蚣草（Pteris vittata）生长在石灰性土壤与石灰岩生境中，也可分布在墙壁石缝中［1］，具有超积累有害砷离子的功能，被用于砷离子污染土壤的修复［2-5］。蜈蚣草的根和叶具有吸收、转运以及解毒砷离子能力［5-8］。已有研究表明，除蜈蚣草外，凤尾蕨属（Pteris）其他几种植物对砷离子和镉离子也具有超积累作用［5-7］。

蕨类植物已经进化出各种形态解剖学结构，以适应陆生、旱生、附生、岩生以及水生环境［9-17］。因此，该类群植物在分类学和系统进化研究等方面具有重要意义［18-23］。蕨类植物的不定根有1 个由初生木质部和初生韧皮部组成的中柱，中柱外具内皮层以及木质化细胞壁的皮层，可能缺少木质化外皮层［17，24-27］。有些蕨类植物的根被（velamen）、根表皮以及根毛富含果胶，有助于离子吸收［28-30］。蕨类植物的根茎和复叶的结构中通常由内皮层、厚壁组织层和角质层充当质外体屏障［11，17，31-34］。在其他维管植物中，这种屏障结构通常由内皮层或环内皮层带和外皮层组成，用来限制水溶性物质的交换、减少淹没条件下氧气的损失或是减少陆生环境下水分的丧失［17，35-49］。就根的通透性而言，在虉草（Phalaris arundinacea）、茭白（Zizania latifolia）以及蒿属（Artemisiasp.）植物中，外皮层吸收和限制黄连素离子［42，47-48，50］，在空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）以及十字花科（Brassicaceae）某些植物体内，木质化皮层和皮下层限制离子出入［43，51-54］。

以往凤尾蕨属植物的系统发育以及个体发育的研究是以解剖学特征为基础的，特别是植物体内存在的网状中柱以及内皮层结构，但这些结构的个体特异性研究并不充分［11-12，17］。本研究旨在明确蜈蚣草的解剖结构与组织化学特征是否能使其适应干旱的岩生环境，并探究这些结构特征与离子通透性之间的联系，以阐明这种植物对重金属的超积累作用的机制。研究结果也可为该物种及其近缘种的分类、进化以及系统发育的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料的收集与处理

在湖北省荆州市古城墙采集生长在砖缝中的蜈蚣草成熟植株样本。该区域的蜈蚣草植株的气生根在墙壁上形成了密集的簇状垫。2020 年10月，从5 株不同的植株中各收集了10 条根、5 块根状茎和10 片叶，立即置于FAA 固定液中［55］。此外，还采集了9 株完整的植株，包括附着的不定根垫，用于质外体通透性试验［42-43，45，47-48］。

1.2 解剖结构与组织化学特征

在立体解剖镜（JNOEC JSZ6，中国）下用双面刀片对植物材料徒手切片。从距根尖5、10、20、30 mm 处横切不定根。对复叶总叶柄和叶片，则在材料中部进行横切。根状茎分为2部分：幼嫩部分（距离顶端约5 mm，表面呈绿色）和成熟部分（距离顶端约15 mm），分别在这2 个部位进行横切。根据染色方法不同将每种切片分为3组，每组切片采自3～6个不同的植物材料。

每组切片分别用以下3 种染色剂进行染色：1 g·L-1苏 丹 红7B 用 于 检 测 栓 质 化 细 胞 壁［56］；1 g·L-1硫酸氢黄连素-苯胺蓝（BAB）用于检验凯氏带和木质化细胞壁［57-58］；2 g·L-1钌红用于检测细胞壁中的果胶［30，59］。

所有样本染色后均用无菌水清洗2～3 次，并用无菌水固定，之后置于徕卡光学显微镜（Leica DME，德国）之下用明亮视野观察。并用数码相机（Nikon E5400，日本）和千分尺对标本拍照记录。BAB 染色的标本在荧光显微镜（Olympus IX71，日本）蓝色激发光（450～480 nm）下观察，并用单色数码相机（RZ200C-21，中国）记录510 nm 以上波长的荧光［41］。

1.3 质外体通透性

参考Seago等［58］和Meyer等［60］的质外体通透性试验并对其方法进行了修改：将完整的植株的根部浸入溶液中。这种修改的目的是为了保持植株的完整性，从而可以通过通透性试验来评估植物是如何吸收离子的。

三分之一的根不染色做空白对照；三分之一的根浸入100 mL、0.05%的硫酸氢黄连素中1 h，并用无菌水洗涤；最后三分之一的根浸入100 mL、0.05%硫酸氢黄连素中1 h，用无菌水洗涤后浸入0.05 mol·L-1硫氰酸钾中0.5 h，再次用无菌水洗涤。按Meyer 等［60-61］和Seago 等［58］所述，根部被徒手切开并在紫外光下观察。

2 结果与分析

蜈蚣草的气生根中柱具原生木质部和后生木质部（见图1）。在距根尖10 mm 处，内皮层有凯氏带（图1A 右侧）且细胞壁栓质化，并有少量的通道细胞。根表面覆盖有表皮和根毛并且发出强烈的黄色荧光（图1A 左侧）。从内皮层到表皮的细胞壁和根毛富含果胶（图1：A～C）。此外，在距根尖10 mm 处，皮层内部的木质化厚壁组织层包围着内皮层；在距根尖20 mm 处，厚壁组织层进一步增厚，并且富含木质素和果胶（图1：C～F）；在距根尖20～30 mm 处，中柱有明显的后生木质部，并且表皮和根毛继续保持强烈的黄色荧光（图1：G、H）。

图1 蜈蚣草不定根的解剖结构（长度20～56 mm）A～C.距根尖10 mm处；D～F.距根尖20 mm处；G～H.距根尖30 mm处；A、D、G.硫酸氢黄连素-苯胺兰染色，置于紫外光下观察；B、E、H.苏丹红7B染色，明亮视野下观察；C、F.钌红染色，明亮视野下观察；A.原生木质部，内皮层（箭头），通道细胞，木质化皮层（*），皮层，表皮，根毛；B.原生木质部，内皮层（箭头），皮层，表皮，根毛；C.内皮层（箭头），皮层，表皮，根毛；D.原生木质部，内皮层（箭头），木质化皮层（*），皮层，表皮，根毛；E.后生木质部，内皮层（箭头），木质化增厚皮层（*），皮层，表皮，根毛；F.后生木质部，内皮层（箭头），皮层，表皮，根毛；G.后生木质部，内皮层（箭头），木质化皮层（*），皮层，表皮，根毛；H.后生木质部，内皮层（箭头），木质化增厚皮层（*），皮层，表皮，根毛；co.皮层；cu.角质层；h.根毛；hy.皮下层；mx.后生木质部；pa.栅栏组织；pc.通道细胞；px.原生木质部；rh.表皮；sp.海绵组织；vb.维管束；ve.叶脉Fig.1 Photomicrographs of crosscutting of the adventitious roots of P.vittata（Length 20～56 mm）A-C.Sectioned at 10 mm from the root tip；D-F.Sectioned at 20 mm from the root tip；G-H.Sectioned at 30 mm from the root tip；A，D，G.Stained with berberine hemisulfate-aniline blue，under ultraviolet light；B，E，H.Stained with Sudan Red 7B，under brightfield；C，F.Stained with ruthenium red，under brightfield；A.Protoxylem，endodermi（sarrow），passage cells，lignified cortex（*），cortex，rhizodermis，hairs；B.Protoxylem，endodermis（arrow），cortex，rhizodermis，hairs；C.Endodermi（sarrow），cortex，rhizodermis，hairs；D.Protoxylem，endodermi（sarrow），lignified cortex（*），cortex，rhizodermis，hairs；E.Metaxylem，endodermis（arrow），lignified thickened cortex（*），cortex，rhizodermis，hairs；F.Metaxylem，endodermi（sarrow），cortex，rhizodermis，hairs；G.Metaxylem，endodermis（arrow），lignified cortex（*），cortex，rhizodermis，hairs；H.Metaxylem，endodermis（arrow），lignified thickened cortex（*），cortex，rhizodermis，hairs；co.Cortex；cu.Cuticles；h.Hairs；hy.Hypodermis；mx.Metaxylem；pa.Palisade tissue；pc.Passage cells；px.Protoxylem；rh.Rhizodermis；sp.Spongy tissue；vb.Vascular bundles；ve.Vein

图2 蜈蚣草根的质外体通透性（长度20～50 mm）A～B.距根尖5 mm 处；C～D.完整的根尖；E～H.距根尖10 mm 处；I～L.距根尖20 mm 处；A、E、L.未染色，明亮视野下观察；B、F、J.未染色，紫外光下自发荧光；C、G、K.用黄连素示踪剂处理并在紫外光下观察；D、H、L.用黄连素与KSCN 溶液处理并在紫外光下观察；A.皮层，表皮，根毛；B.木质化增厚皮层（*）；C.根尖显示出强烈的黄色荧光（箭头）；黄连素染色下的根表皮表面和根毛（箭头）；D.根尖显示出强烈的黄色荧光（箭头）；黄连素与KSCN 染色下的根表皮表面和根毛（箭头）；E.木质化增厚皮层（*），皮层，表皮，根毛；F.原生木质部，木质化增厚皮层（*），根毛；G.原生木质部，木质化皮层（*），皮层；黄连素染色的根表皮和根毛；H.初生木质部，木质化增厚皮层（*），皮下层；硫氰酸黄连素染色的根表皮和根毛；I.木质化增厚皮层（*），皮层，表皮，根毛；J.原生木质部，内皮层（箭头），木质化增厚皮层（*）；K.原生木质部，内皮层（箭头），木质化皮层（*），皮层；黄连素染色的根表皮和根毛；L.后生木质部，内皮层（箭头），木质化皮层（*），皮层；硫氰酸黄连素染色下的根表皮和根毛Fig.2 The permeability of the apoplastic barriers in the roots of P.vittata（Length 20～50 mm）A-B.Sectioned at 5 mm from the root tip；C-D.Intact root apex；E-H.Sectioned at 10 mm from the root tip；I-L.Sectioned at 20 mm from the root tip；A，E，I.Unstained，under brightfield；B，F，J.Unstained，autofluorescence under ultraviolet light；C，G，K.Treated with berberine tracer under ultraviolet light；D，H，L.Treated with berberine and KSCN solution under ultraviolet light；A.Cortex，rhizodermis，hairs；B.Lignified thickened cortex（*）；C.Root tip showing strong yellow fluorescence（arrow）；rhizodermis surface and hairs stained with berberine（arrow）.；D.Root tip showing strong yellow fluorescence（arrow），rhizodermis surface and hairs stained with berberine thiocyanate（arrow）；E.Lignified thickened cortex（*），cortex，rhizodermis，hairs；F.Protoxylem，lignified thickened cortex（*），hairs；G.Protoxylem，lignified cortex（*），cortex；rhizodermis and hairs stained with berberine；H.Protoxylem，lignified thickened cortex（*），hypodermis；rhizodermis and hairs stained with berberine thiocyanate；I.Lignified thickened cortex（*），cortex，rhizodermis，hairs；J.Protoxylem，endodermis（arrow），lignified thickened cortex（*）；K.Protoxylem，endodermis（arrow），lignified corte（x*），cortex；rhizodermis and hairs stained with berberine；L.Metaxylem，endodermi（sarrow），lignified cortex（*），cortex；rhizodermis and hairs stained with berberine thiocyanate

根状茎的网状中柱具原生木质部和后生木质部，中柱外被内皮层环绕，内皮层细胞壁栓质化（图3：A～D）。皮层由薄壁组织构成的，表皮表面拥有角质层（图3A）；成熟的复叶叶柄中弧形排列的内皮层环绕着维管组织，且叶柄具皮层、周缘木质化厚壁组织层和具有角质层的表皮（图4：A～D）。内皮层具有凯氏带且栓质化；叶片分化出栅栏组织与海绵组织，叶脉外环绕的内皮层具有凯式带（图4：E～G）。叶片上下表皮都覆盖有角质层（图4：E～G）。气孔只存在于叶片的下表皮（图4：H～J）。

图3 蜈蚣草根茎显微结构（长度19～42 mm）A.维管束，内皮层（箭头），皮层，表皮，角质层；苏丹红7B 染色并在明亮视野下观察；插图展示了表皮表面的角质层，苏丹红7B 染色；B.维管束，原生木质部，内皮层（箭头），皮层；硫酸氢黄连素-苯胺兰染色；C.维管束，后生木质部；皮层；插图展示了内皮层（箭头），硫酸氢黄连素-苯胺兰染色；D.维管束，内皮层（箭头），皮层；苏丹红7B染色Fig.3 Photomicrographs of crosscutting of the rhizomes of P.vittata（Length 19～42 mm）A.Vascular bundles，endodermis（arrow），cortex，epidermis，cuticle；Stained with Sudan Red 7B under brightfield；Insets shows the cuticle on the epidermal surface，stained with sudan red 7B；B.Vascular bundles，protoxylem，endodermis（arrow），cortex；Stained with berberine sulfate-aniline blue；C.Vascular bundles，metaxylem；Insets shows the endodermi（sarrow）；Stained with berberine sulfate-aniline blue；D.Vascular bundles，endodermi（sarrow），cortex；Stained with sudan red 7B

图4 蜈蚣草成熟柄和叶的显微结构所有图片展示的均为硫酸氢黄连素-苯胺兰染色并置于紫外光下观察（除特殊说明）；A.叶柄部分。维管束，皮层，外围厚壁组织层（*）；上方插图展示了栓质化内皮层（箭头）；下方插图展示了表皮表面的角质层；两张插图的样本均用苏丹红7B 染色并再明亮视野下观察；B.图A中维管束，内皮层（箭头），皮层，外围厚壁组织层（*）的放大图；C.中央叶脉切面；维管束，内皮层（箭头），皮层，外围厚壁组织层（*），角质层；D.中央叶脉切面；维管束，内皮层（箭头），皮层，外围厚壁组织层（*），角质层。苏丹红7B染色并在明亮视野下观察；E.叶片部分，叶片正面向上；栅栏组织，海绵组织，角质层；F.叶片部分，叶片正面向上；细叶脉内皮层（箭头）；G.叶片部分，叶片正面向上；栅栏组织，海绵组织，细叶脉，内皮层（箭头），角质层；苏丹7B 染色，并在明亮视野下观察；H.叶片背面；气孔（箭头）；无染色，在明亮视野下观察；I.叶片正面；表皮细胞（*）Fig.4 Photomicrographs of the mature stipes and leaves of P.vittata All panels showed berberine hemisulfate-aniline blue staining under UV light，except where noted；A.Stipe section. Vascular bundles，cortex，peripheral sclerenchyma layer（*）；Upper inset shows the suberized endodermis（arrow）；Lower inset shows the cuticle on the epidermal surface. Insets stained with Sudan Red 7B under brightfield；B.Magnification of panel A；Vascular bundles，endodermi（sarrow），cortex，peripheral sclerenchyma laye（r*）；C.Section of the pinna vein；Vascular bundles，endodermi（sarrow），cortex，peripheral sclerenchyma laye（r*），cuticle；D.Section of the pinna vein；Vascular bundles，endodermi（sarrow），cortex，peripheral sclerenchyma laye（r*），cuticle；Stained with Sudan Red 7B under brightfield；E.Leaf blade section，adaxial side up；Palisade tissue，spongy tissue，cuticle；F.Leaf blade section，adaxial side up；Fine vein endodermi（sarrow）；G.Leaf blade section，adaxial side up；Palisade tissue，spongy tissue，fine vein，endodermi（sarrow），cuticle；Stained with Sudan Red 7B，under brightfield；H.Abaxial surface of leaf blade；Stoma（arrow）；Unstained，under brightfield；I.Adaxial surface of leaf blade；Epidermi（s*）

3 讨论

蜈蚣草中观察到的解剖结构、组织化学特征和离子通透性模式与其在岩生环境中成功定居，以及离子超积累特性相一致。蜈蚣草的不定根和复叶叶轴都具有内皮层，且内皮层拥有栓质化的凯氏带，内皮层外部被木质化的厚壁组织层环绕。在维管植物根的结构中，内皮层和厚壁组织层作为屏障结构和机械组织对植物起保护和支撑作用［62-64］，因此，这些结构的存在表明了蜈蚣草对旱生环境的适应性［13，17，24，32，36］。尽管几乎所有的维管植物都具有栓质化的凯氏带以及木质化的厚壁组织层，但这些特征所在的组织和器官在不同分类群之间有着显著的差异［11，17，35-37］。与蜈蚣草类似，陆生蕨类植物荷叶铁线蕨（Adiantum reniformevar.sinense）、铁角蕨属（Aspleniumsp.）植物、以及附生植物大果百生蕨（Pleopeltis macrocarpa）都拥有围绕着维管束的1 个内皮层和1 个厚壁组织层［15，32，65］；这表明了蜈蚣草与这些适应旱生环境的植物拥有相似的保护组织，以适应干旱或缺水环境的生长。

与Bondada等［66］的研究结果一致，蜈蚣草的不定根具内皮层和木质化的厚壁组织层，这些特点与其他的许多蕨类植物类似，包括附生植物二歧鹿角蕨（Platycerium bifurcatum）［24］、陆生植物铁角蕨属［15，26，65，67］、玉柏（Lycopodium obscururn）、卷柏属（Selaginellasp.）［25］、多盾蕨属（Pleopeltissp.）［32，68］、Doryopteris triphylla［13］以及荷叶铁线蕨［17］等。这些植物的根与蜈蚣草的根还有其他几个相似之处，如荷叶铁线蕨和二歧鹿角蕨的内皮层栓质化［17，24］，二歧鹿角蕨、多盾蕨属和Doryopteris triphylla的根具有两层或多层细胞组成的厚壁组织层［13，24-25，32，68］。然而与蜈蚣草根不同的是，卷柏属的根具有1个外皮层［25］，铁角蕨属的根表皮具螺旋状增厚［15］，二歧鹿角蕨、大果百生蕨以及荷叶铁线蕨的单层细胞厚壁组织层中具有异细胞［17，24，32］。蜈蚣草与这些物种根部结构上的相似性表明了蜈蚣草根对干旱的岩生环境有较好的适应能力［24-25，32，66，68］。

蜈蚣草根表皮细胞壁以及根毛富含果胶，类似于在兰科（Orchidaceae）植物根中观察到的富含果胶的根被［28-30］，这种根被可在空气中捕获离子。蜈蚣草的根表皮细胞壁和根毛积累了大量的黄连素，类似于莼菜（Brasenia schreberi）［69］黏液毛中多糖在体内的积累［45，68］，以及镉（Cd）特异性荧光探针（LeadmiumTMGreen AM dye）在超积累生态型东南景天（Sedum alfredii）根表皮细胞壁以及根毛中的积累［70］。蜈蚣草的木质化皮层与硒（Se）的超积累植物壶坪碎米荠（Cardamine hupingshanensis）［40］类似。已有研究表明，虉草、茭白以及蒿属植物只有外皮层吸收黄连素［42，47-48，50］，而在空心莲子草以及十字花科植物体内，木质化皮层和皮下层限制离子出入［43，51-54］，这一点类似于蜈蚣草的木质化的厚壁组织层。此外，BAB 染色后蜈蚣草根表皮表面以及根毛保留大量黄连素离子，与此不同的是荷叶铁线蕨根表皮表面几乎不保留黄连素离子［17］，而水杉（Metasequoia glyptostroboides）［44］、壶坪碎米荠［40］和空心莲子草［43］则没有这一现象。这些观察结果表明，蜈蚣草根的结构特征有利于离子的保留和超积累，相比之下表面不保留黄连素离子的根部结构则缺少这种能力。

蜈蚣草的根状茎结构由内而外包括：网状中柱、内皮层、皮层、表皮和角质层。该根状茎的结构类似于其他陆生蕨类植物，例如球子蕨（Onoclea sensibilis）［71］、多 足 蕨 属（Polypodiumsp.）植物［72］、蜡腺蕨属（Ceradeniasp.）［73］、Blotiella lindeniana［74］和Doryopteris triphylla［13］。另外，附生和旱生物种，例如铁角蕨属、大果百生蕨和贴生石韦（Niphobolus adnascens），表皮下有外围厚壁组织层。这些结果表明了蜈蚣草在一定程度上适应旱生环境，但适应性程度可能不如铁角蕨属等的植物［15，32］。

与其他的凤尾蕨属植物类似［10-11，34，66］，蜈蚣草的叶柄结构中有弧形排列的内皮层和位于表皮之下的外围木质化的厚壁组织层。这些结构还与其他几种蕨类植物的叶柄结构类似，如双穗蕨属（Anemiaspp.）植物［31］、骨碎补属（Davalliaspp.）植物［75］、乌毛蕨属（Blechnumspp.）植物［76］、铁角蕨属植物［15］、Doryopteris triphylla［13］、大果百生蕨［32］和荷叶铁线蕨等［17］。在铁角蕨属植物中，叶柄内皮层周 围 环 绕 着1 个 厚 壁 组 织 层［15］，而Doryopteris triphylla叶柄表皮覆盖有厚的角质层，这些结构特征都与蜈蚣草类似［13］。

蜈蚣草叶片中，叶脉周围环绕着1层具凯氏带且栓质化的内皮层，内皮层外方是木质化的厚壁组织层，表皮外覆盖角质层，气孔分布于下表皮。这些结构与铁线蕨属（Adiantumsp.）和Anemiasp.植物叶片类似［17，31，33］，都作为质外体屏障，说明蜈蚣草可以很好地适应陆生环境。蜈蚣草的叶片为异面叶，这说明相比于阴生植物（如黄连（Coptis chinensis）、Doryopteris pentagona、海金沙（Lygodium japonicum）、井栏边草（Pteris multifida）、肾蕨（Nephrolepis cordifolia）和剑叶凤尾蕨（Pteris ensiformis），这些物种都具有等面叶［1，77-78］），蜈蚣草能更好地适应阳生环境。旱生蕨类植物，如Cheilanthes glauca、铁角蕨属和Doryopteris triphylla，气孔大多分布于叶背面，并且表皮外覆盖厚的角质层［1，13，17，78-80］。蜈蚣草叶片的保护组织可能反应了其对旱生环境的适应。

4 结论

蜈蚣草地上不定根、根茎、叶柄和叶片的几种结构与其对干旱的岩生环境的适应性一致，这些结构包括内皮层、木质化的厚壁组织层、异面叶和表皮外覆盖的角质层。此外，根表皮和根毛表面富含果胶并且皮层木质化，黄连素通透性试验表明了这些结构可以保留大量的黄连素离子，这些结果与蜈蚣草对离子的超积累特性相一致。因此，蜈蚣草解剖结构及其组织化学特征与其适应干旱的岩生环境以及超积累离子的特性有密切联系。