白桦BpSPL9基因抑制表达载体的构建及遗传转化研究

杜金霞 申婷婷 王浩然 林一萍 李慧玉 张连飞

（1. 长春职业技术学院现代农学院，长春 130000；2. 黑龙江省庆安国有林场管理局，哈尔滨 150000；3. 东北林业大学，哈尔滨 150000）

SPL基因是植物特异性转录因子［1］。SPL家族基因的共同特征是包括1 个高度保守的76 个氨基酸残基SBP结构域。该结构域包含DNA结合所必需的2 个锌结合位点和C 末端的核定位信号（NLS）［1-2］。SPL基因首先在金鱼草（Antirrhinummajus）中被鉴定，能够与花分生组织识别基因SQUAMOSA启动子结合［1］。此后，SPL基因在绿藻、苔藓以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、苹果（Malus pumila）和毛果杨（Populus trichocarpa）等其他物种［3-6］中陆续被发现。随着研究的深入，SPL基因的功能也逐渐明晰，研究发现SPL基因的表达水平受miR156/157的调控，在植物生长和生理的各个方面发挥着关键作用，包括植物胚胎［7］、叶原基形成［8］、组织和营养相的变化［9］、光信号的转导、次生代谢［10］和胁迫反应［11］。抑制AtSPL3的表达会导致拟南芥提前开花［9］。At-SPL3/4/5通过调节关键下游基因AtAP1、AtFUL和AtLFY的表达，参与花分生组织的发育［12］。Os-SPL16通过增加细胞分裂和籽粒灌浆，有效地提高稻米品质和产量，说明该基因对水稻（Oryza sativa）籽粒发育具有积极的影响［13］。OsSPL14抑制水稻分蘖数量，但促进穗分枝以增加粒质量［14］。在拟南芥中，SPL9干扰MYB-bHLH-WD40 转录复合体形成，抑制DFR的表达，从而抑制花青素的合成［10］。在低温下（5 ℃），葡萄VvSBP3和VvSBP5均上调，但VvSBP4和VvSBP7下调，表明VvSBP3和VvSBP5与葡萄的低温反应相关［15］。人们对拟南芥和水稻中SPL基因的功能了解很多，但对白桦（Betula platyphylla）中SPL基因的了解有限。

EAR 型转录抑制子是植物特有的一类转录抑制子，在激活子C 末端附加一段EAR 基序，形成融合蛋白，可将其转变为一个高效的负调控子，该技术被称为嵌合抑制子沉默技术（CREST）。CREST 在研究转录因子家族基因功能中应用广泛，其最大优点是可以克服基因冗余性的影响。迄今为止，对SPL基因的功能分析在木本植物中研究较少，尤其是白桦。根据第九次森林清查结果，白桦是我国蓄积量第二的树种，也是天然次生林更替的先锋树种。在前期研究中，通过白桦转录组及白桦基因组序列比对，共获得了12 条SPL基因，系统进化分析发现SPL家族分6 个亚类，其中SPL9属于第Ⅲ类，这一类基因除含有SBP 结构域外，基因长度差异较小［5］。本研究采用CREST 技术构建BpSPL9-EAR 的植物表达载体，遗传转化后，对获得的转基因白桦株系进行表型分析，探讨BpSPL9基因对白桦生长发育的影响，为进一步阐明白桦SPL9基因的生物学功能提供参考。

1 方法

1.1 RT-PCR扩增SPL9-EAR序列

根据白桦SPL9基因序列［5］，设计特异引物SPL9-F（5′-CACCATGAAAATGGGTTCGGGTTC-3′ ） 、SPL9-R （5′-TCAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAGAAGTGACCAGTGCATCT -GC-3′），该引物用于克隆SPL9基因的不含终止密码子的ORF 序列，并在3′端加上编码12 个核苷酸的EAR 基因序列［16-17］。采用RNA 提取试剂盒（购自百泰克生物技术有限公司）提取白桦叶片总RNA，反转录为cDNA（购自北京全式金生物），稀释后为模板，PCR 扩增反应体系：2.0 μL 10×KOD Buffer、2.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、SPL9-F和SPL9-R 引物各0.6 μL，2.0 μL cDNA、0.3 μL KOD Plus Neo，DNAfree 水补足到20.0 μL。反应程序：94 ℃2 min后，94 ℃45 s，58 ℃45 s，72 ℃1 min，35个循环后72 ℃7 min。目的片段经琼脂糖凝胶电泳检测后进行回收纯化。

1.2 Gateway方法构建SPL9抑制表达载体

纯化后的PCR 产物通过TOPO 反应连接到入门载体pENTR（pENTRTM/D-TOPO Cloning Kit，Invitrogen）上，转化大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞，挑取单克隆进行PCR 检测，将阳性菌落送至北京擎科生物科技有限公司进行测序分析。提取测序分析正确的阳性单克隆质粒，进行LR 反应，将SPL9-EAR 重组至pGWB2 载体上。将重组质粒pGWB2-BpSPL9-EAR 转化EHA105 感受态细胞（购自擎科生物有限公司），在LB+50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1利福平的固体培养基上进行筛选，PCR 检测为阳性的单克隆作为侵染白桦用的工程菌。

1.3 白桦树遗传转化及分子检测

通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的白桦合子胚转化法进行白桦的遗传转化［18］。为检测目的基因是否成功导入到白桦中，分别以潮霉素抗性白桦株系及非转基因对照白桦株系（WT）的总DNA为模板，SPL9-F和SPL9-R为引物，pGWB2-BpSPL9 质粒和WT 的DNA 分别为阳性和阴性对照，同时设水对照，进行PCR扩增。

1.4 转基因株系的表型观测

将BpSPL9-EAR 转基因白桦及对照白桦组培扩繁，生根后移栽到相同基质（V（黑土）∶V（草炭土）∶V（蛭石）=2∶2∶1）中，放到在植物培养室中培养，培养条件：室温25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。2个月后测定苗高、地径、节间距及叶面积。选择Bp-SPL9-EAR 转基因白桦株系和WT 株系内长势一致、健康的各10株，分别取第7和8片叶，扫描仪扫描后用ImageJ 软件分析叶面积。各株系的苗高、地径及叶面积数据用SPSS 进行多重比较和方差分析。

1.5 内源植物激素测定

取以上株系内长势一致、无病虫害的植株嫩叶，多株混合后采用酶联免疫法（购自中国农业大学）测定植物内源激素，每个样品测3次。

2 结果与分析

2.1 BpSPL9-EAR克隆及植物表达载体构建

以白桦叶片cDNA 为模板，根据BpSPL9ORF序列设计含有12 个氨基酸的EAR 的特异引物，经PCR 获得BpSPL9-ERA 片段，电泳检测结果显示：在1 176 bp处获得特异条带，并与目标条带大小一致（见图1）。纯化后的PCR 产物经TOPO 反应后，其中3 个单克隆PCR 检测为阳性，选取电泳条带亮度最高的2个单克隆进行测序分析，测序结果证明已成功克隆BpSPL9，并成功构建到了pENTR 载体上（见图2）。提取经PCR 及测序检测为阳性克隆的质粒进行LR 反应（见图3），挑取的9 个单克隆进行PCR 检测，其中6 个PCR 检测为阳性，说明已成功构建pGWB2-BpSPL9-EAR载体。

图1 BpSPL9-EAR片段PCR产物电泳图谱M.Marker DL2000；1.水对照；2.BpSPL9基因Fig.1 Electrophoresis of PCR product of BpSPL9-EAR fragment M.Marker DL2000；1.Water control；2.BpSPL9 Genes

图2 pGWB2-BpSPL9-EAR载体图谱及PCR检测M.Marker DL2000；1.水对照；2～7.重组子Fig.2 Vector of pGWB2-BpSPL9-EAR M.Marker DL2000；1.Water control；2-7.Recombination element

图3 pGWB2-BpSPL9-EAR载体PCR检测M.Marker DL2000；1.阳性对照；2.水对照；3～11.大肠杆菌转化子Fig.3 Vector of pGWB2-BpSPL9-EAR M.Marker DL2000；1.Positive control；2.Water control；3-11.Escherichia coli invertor

2.2 转BpSPL9-SRDX白桦株系的获得

将构建好pGWB2-BpSPL9-EAR 载体转化到EHA105后，以白桦合子胚为外植体进行侵染。将侵染后的白桦合子胚在Woody Plant medium（WPM）+1.0 mg·L-1细胞分裂素（6-BA）+0.2 mg·L-1萘乙酸（NAA）上共培养2 d后，转至WPM+0.8 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1赤 霉 素（GA3）+50 mg·L-1潮霉素上，并在选择培养后加入头孢霉素抑制农杆菌生长，20 d 左右在切口处长出愈伤；待愈伤组织长到5 cm 左右，将其切下进行再分化培养，最终获得4 个抗性株系，分别命名为Bp-SPL9-SRDX-1～BpSPL9-SRDX-4。

分别以4 个转BpSPL9白桦株系及WT 叶片DNA 为模板，进行PCR 扩增验证外源基因是否已进入白桦基因组中（见图4），电泳结果显示：4个转化子均能够检测与阳性对照大小一致的目的条带，而WT 中没有检测出条带，说明BpSPL9-EAR已成功整合到白桦基因组中。

图4 转BpSPL9基因植株的PCR检测M.Marker DL2000；1.pGWB2-BpSPL9-EAR 质粒；2.水；3.WT；4～7.转化子Fig.4 PCR of BpSPL9 transgenic lines M.Marker DL2000；1.pGWB2-BpSPL9-EAR plasmids；2.Water；3.WT；4-7.Transformants

2.3 转基因株系的苗高、地径及节间距变化

2.3.1 BpSPL9基因调控白桦的苗高和地径生长

对转基因及对照株系进行组培扩繁后移栽，2个月后测量苗高及地径，结果表明：除SPLSRDX-4外，其他3个转基因株系苗高与非转基因白桦差异均达到极显著水平（P＜0.05），转基因株系的苗高显著低于WT 白桦（P＜0.05），其中SPLSRDX-2 和SPLSRDX-3 株系的苗高分别比WT 低30.34%和25.86%。转基因株系地径与WT 差异不显著（P＞0.05）（见图5）。

图5 BpSPL9-SRDX白桦株系的苗高及地径Fig.5 Analysis of seedling height and diameter of transgenic BpSPL9-SRDX lines

2.3.2 BpSPL9基因影响白桦节间距

对移栽2个月的转基因和WT株系节间距进行测定，结果显示：WT节间距主要分布在10～14 mm，而转基因白桦的节间距变短，多数分布在8～14 mm，尤其是SPLSRDX-1株系，在6～8 mm 也有较多分布（见图6）。表明BpSPL9影响白桦的节间距。

图6 转BpSPL9-SRDX株系的节间距分布Fig.6 Node spacing distribution of transgenic BpSPL9-SRDX lines

2.3.3 转基因株系的叶面积变小

对转基因白桦与WT的第7和8片叶的叶面积进行分析，结果表明：转基因和WT 株系的叶面积达到极显著水平（P＜0.01），BpSPL9-SRDX-1 和Bp-SPL9-SRDX-4 的第7 片叶叶面积分别低于WT 叶面积的42.87%和38.96%，BpSPL9-SRDX-1 和Bp-SPL9-SRDX-2 的第8 片叶面积分别低于WT 的50.91%和47.82%（见图7）。

图7 转BpSPL9抑制表达株系的叶面积Fig.7 Analysis of leaf area of transgenic BpSPL9-SRDX lines

2.4 转基因株系的内源植物激素

选取苗高最低的2 个转基因株系BpSPL9-SRDX-2 和BpSPL-SRDX-3 与WT，测定吲哚-3-乙酸（IAA）和6-苄氨基嘌呤（6-BA）的变化情况，株系内多株混样并做3次平行重复试验，结果表明：各株系间6-BA和IAA含量差异显著（P＜0.05），转基因株系2 种激素含量均低于对照株系，尤其是BpSPL9-SRDX-2株系的IAA含量明显低于WT（见图8）。

图8 转基因株系的激素质量分数Fig.8 Hormone content of transgenic lines

3 讨论

大多数的SPL转录因子具有相似的表达模式，有研究表明，SPL转录因子存在于许多植物中，主要参与调控植物的花、叶、胁迫等过程。在麻风树（Jatropha curcas）中JcSPLs具有多样的时空表达模式，JcSPL3在7 或10 年生麻风树所有组织中的表达水平最高，并且随着树龄的增长呈现出增加的趋势，这表明它在麻风树年龄发育的调节中起着重要作用［18］。所有的拟南芥AtSPLs基因都在花分生组织和花器官（萼片、花瓣、雄蕊和心皮）及茎、叶、根等营养器官中表达［3］。结合转录组和qRT-PCR 分析的结果，发现大多数小麦TaSPL基因调控花序和穗发育。在十字花科（Brassicaceae）植物花和茎发育过程中，BjuSPL3a_B、BjuSPL2b_B和BjuSPL2c_A在花中显著表达，而BjuSPL3b_B和BjuSPL10a_A在茎节中显著表达［19］，说明这2 个SPL可能参与茎节发育过程。前期研究发现，白桦SPL9基因在叶、芽、茎、雄花和雌花中均有表达［5］，初步证明SPL9可能参与这几个组织部位的发育过程。

为了进一步揭示SPL9的功能，构建了Bp-SPL9-ERA 载体，转化白桦后观测转基因株系的表型。转BpSPL9抑制表达白桦表现出的苗高降低，节间距变短及叶面积变小的表型。

在拟南芥中过量表达AtSPL9和AtSPL10都可以延长叶片的间隔期，并降低叶片生成速率，导致叶片数量减少，叶面积增大［20］。种子萌发阶段，At-SPL13基因上调表达，叶原基发育受到抑制，进而影响了第1 片叶的形成。AtSPL9基因还在叶片形状和表皮毛的形成起作用［21-23］。BpSPL9同样影响白桦叶片大小，但对表皮毛的影响不明显。在陆地棉（Gossypium hirsutum）GhSPL3和GhSPL18过表达拟南芥植株的表型观测表明，这2个基因参与了叶片和第2芽的发育。SPL可能通过抑制YUC2和YUC6的转录来调节生长素的内环境稳定，并参与侧器官包括叶片的形态发生［24］。小麦（Triticum aestivum）TaSPL8基因敲除突变体叶片接合处缺失，叶片直立，结构紧凑，穗数增加，TaSPL8与生长素反应因子基因和油菜素类固醇生物发生基因CYP90D2的启动子结合并激活其表达［25］。BpSPL9的下调表达同样引起了白桦的节间距变短。在玉米（Zea mays）和水稻中，SPL家族成员UB3通过调节参与细胞分裂素生物合成和信号传导的LOG1和ARRs的表达，调节营养和生殖分支［26］。在白桦中，BpSPL9抑制表达株系生长素和细胞分裂素含量减低，苗木表现出苗高、节间距和叶片大小的变化该性状与AtSPL9和AtSPL10相似，说明SPL基因调控叶片发育方面在木本与草本植物中相对保守。推测BpSPL9可能通过影响生长素和细胞分裂素的合成，从而调控白桦的生长发育。后续还需要进一步分析该转录因子在白桦生长发育中的调控机制。