雷公藤甲素通过TLR4/NF-κB 通路对过敏性鼻炎模型大鼠的治疗作用及机制研究

桑 飞，王 霞，郭 鑫，李 伟

（乌鲁木齐市妇幼保健院药剂科，乌鲁木齐 830001）

过敏性鼻炎（AR）是一种常见的慢性炎症性疾病[1-3]。Toll 样受体（TLR）2 和TLR-4 通过与细胞受体结合来控制炎症功能障碍，Toll 样受体（TLRs）在其中发挥重要作用[4]。TLR/NF-κB 信号通路是与抗炎免疫机制密切相关的信号通路，该通路在过敏性鼻炎发病中发挥重要作用[5]。雷公藤甲素（triptolide，TP）是雷公藤的提取物，用于治疗自身免疫性疾病[6]。雷公藤甲素已被证明通过各种机制，包括caspase 活化和增强p53 活性，具有抗肿瘤作用[7]，本研究通过建立大鼠过敏性鼻炎模型，探讨雷公藤甲素是否通过TLR4/NF-κB 通路降低血清中总IgE 和HIS 含量、调控Th1/Th2 比列的平衡，发挥抗过敏作用。

1 材料与方法

1.1 材料 雷公藤甲素（纯度≥98%）购自上海麦克林生化科技有限公司。鸡卵清蛋白（OVA）和Al（OH）3购自美国Sigma 公司。体质量180～220 g 雄性SD 大鼠购自新疆医科大学医学实验动物中心。ELISA 试剂盒购于美国Abcam 公司。HE 试剂盒和免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥。大鼠周围血液淋巴细胞分离试剂盒和RIPA 裂解液购自北京索莱宝公司。逆转录试剂盒购自Promega 公司。TB GreenTMPremix Ex Taq II 试剂盒购自TaKaRa公司。TLR4 抗体、NF-κB p65抗体和β-actin抗体和山羊抗兔（鼠）IgG 二抗购自美国Cell Signaling Technology 公司。PVDF 膜购自Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与过敏性鼻炎模型制备 将30 只SD大鼠饲养在具有锯屑垫料的标准塑料笼中，室内温度为（22±2）℃，照明控制在14 h 光照/10 h 黑暗循环。SD 大鼠喂养适量的自来水和标准大鼠食物。并且在实验之前使大鼠适应环境至少2 周。将大鼠随机均分为3 组：对照组（Control 组）、过敏性鼻炎模型组（AR组）和雷公藤甲素组（TP 组）。参考文献[8]中模型制备方法，进行卵白蛋白鼻黏膜刺激法模拟过敏性鼻炎模型，除对照组外其余各组大鼠分别从第1 天开始腹腔注射新鲜配置1 mL 含0.3 mg 卵白蛋白、30 mg Al（OH）3的0.9%NaCl 溶液致敏，隔日1 次，连续注射7 次。第 15 天进行免疫加强，通过在双侧鼻腔中滴入继续致敏，每天1 次200 μL 10% OVA，连续7 d。对照组给予等量生理盐水腹腔注射、滴鼻，方法同上。末次滴鼻致敏后，观察所有大鼠在5 min 内的挠鼻次数、喷嚏个数、流涕程度，根据表1 评分标准进行评分，每只大鼠置于透明箱子中观察 30 min，3 个症状分数相加即为总症状评分，总评分≥5 分为造模成功。

表1 过敏性鼻炎模型大鼠症状评分表

1.2.2 药物干预 模型构建成功后，TP 组大鼠予腹腔注射雷公藤甲素100 μg/（kg·d）[9]，对照组和过敏性鼻炎模型组则同步给予等体积生理盐水，每日腹腔注射1 次，各组均连续注射28 d。

1.2.3 鼻部症状评分 分别在第7 天，第14 天与第28天对各组大鼠症状进行评分，方法同上。

1.2.4 HE 染色与甲苯胺蓝（TB）染色 HE 染色可将细胞核染为蓝色，胞浆染为红色，可以将各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点显示出来；TB 染色可将细胞核染为蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，可用于检测组织中肥大细胞。大鼠处死后，取前筛区鼻黏膜组织，并固定在10 %福尔马林溶液中24 h。固定后，组织样品包埋于石蜡中并进行切片（切片厚度5 μm）。将5 μm 厚的组织固定在带正电荷的载玻片上，然后进行脱水-再水化，切片进行苏木精-伊红或甲苯胺蓝染色。所有切片均用光学显微镜进行拍摄。

1.2.5 ELISA 检测大鼠血清中总IgE、HIS、IFN-γ 和IL-4 的含量 实验结束后，大鼠经异氟烷麻醉后于心尖部采血于离心管中，待凝固后，3 000 r/min，离心15 min，分离血清，采用ELISA 试剂盒测定各组大鼠血清中总IgE、HIS、IFN-γ 和IL-4 的含量。

1.2.6 流式细胞术检测CD3+CD4+IFN-γ+Th1 和CD3+CD4+IL-4+Th2 细胞 根据大鼠周围血液淋巴细胞分离试剂盒中的说明书，将大鼠的外周血单核细胞（PBMC）与血液样品分离，并置于含有RPMI 1640的离心管中。在5% CO2的培养箱中用81 ng/mL 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，1.34 μg/mL 离子霉素和3.0 μg/mL 布雷菲德菌素A 刺激PBMC 6 h。随后将细胞用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗大鼠CD3 和别藻蓝蛋白（APC）标记的抗大鼠CD4 抗体在室温下在黑暗中表面染色30 min，然后固定细胞。PBS 洗涤，离心后并均分细胞，然后与藻红蛋白（PE）标记的抗大鼠IFN-γ，抗大鼠IL-4 和抗大鼠IgG1 抗体在室温下在黑暗中孵育15 min。将染色的细胞洗涤1 次，并通过FACSCalibur 流式细胞仪检测，并用CellQuest 软件分析结果。

1.2.7 实时定量 PCR 法（qPCR）检测TLR-4、NF-κB和β-actin 基因表达 使用TRIzol 试剂提取大鼠鼻黏膜组织总RNA，用Nanodrop 2000 仪器检测样品RNA 浓度。然后按照反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录成cDNA。按照qPCR 试剂盒说明书配置相应的体系，每组设置3 个复孔。使用TB GreenTMPremix Ex Taq II 试剂盒进行qPCR。qPCR的条件如下：95 ℃ 30 s（1循环），95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s（40 循环）。使用StepOnePlus 仪器完成实验后，采用2-△△Ct法分析数据。实验独立重复3 次。引物序列见表2。

表2 引物序列

1.2.8 Western blot 检 测TLR-4、NF-κB 和β-actin 蛋 白表达 取大鼠鼻黏膜组织样本，加入1 mL 制备好的RIPA 裂解液提取蛋白，用BCA 法测定总蛋白含量。取等量蛋白质样品上样，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质后转膜，用5 %脱脂奶粉封闭1 h，之后加入稀释后的TLR-4（1:1 000）、NF-κB（1:1 000）和β-actin（1:1 000）一抗，4 ℃摇床上孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 mim，加入对应于一抗种属来源的HRP 标记的二抗（1:1 000），在室温摇床上孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。使用ECL 化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus 图像分析系统对蛋白条带进行分析。

1.2.9 免疫组化检测TLR-4、NF-κB 蛋白的阳性表达 鼻黏膜组织经固定，包埋，石蜡切片、脱水、缓冲液清洗，3 %过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，滴加非免疫动物血清20 min，滴加TLR-4（1:200）和NF-κB（1:200）一抗、PBS 冲洗、滴加二抗（1:500）、冲洗后加ABC 复合物、DAB 显色，在400 倍显微镜下观察，用MIAS 图像分析系统分析，计数标记的阳性细胞数目与总细胞数目，计算阳性表达水平并进行统计[10]。补充免疫组化检测TLR-4、NF-κB 蛋白的阳性表达判断标准，标出相关文献出处。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多因素重复测量结果采用三因素重复测量方差分析，多组间数据比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 雷公藤甲素对过敏性鼻炎大鼠鼻部症状积分的影响 见表1。

表1 各组大鼠症状积分结果（± s，n =10）

表1 各组大鼠症状积分结果（± s，n =10）

注：与Control 组比较，### P ＜0.001；与AR 组比较，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

2.2 雷公藤甲素对过敏性鼻炎大鼠血清中总IgE 和HIS 含量的影响 见图1A 和1B。

图1 雷公藤甲素对过敏性鼻炎大鼠血清中总IgE 和HIS 含量的影响

2.3 雷公藤甲素缓解过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜的组织病理学损伤 HE 和TB 染色检查评估雷公藤甲素对鼻黏膜组织病理学变化的影响（图2）。HE 和TB 染色结果显示，在过敏性鼻炎大鼠的鼻黏膜切片中观察到鼻呼吸上皮破坏，白细胞和肥大细胞浸润以及纤毛细胞减少。与AR 组相比，TP 组大鼠由AR 引起的鼻黏膜损伤显著减轻。

图2 雷公藤甲素对过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜的影响（×200）

2.4 雷公藤甲素对大鼠血清中Th1 和Th2（IFN-γ 和IL-4）的影响 TP组大鼠血清中IFN-γ增加（P＜0.05），IL-4 显著降低（P＜0.001）（图3A 和3B）。TP 组的IFN-γ/IL-4 值较AR 组增加（P＜0.05）（图3C）。

图3 雷公藤甲素对AR 大鼠血清中IFN-γ 和IL-4 含量的影响

2.5 雷公藤甲素对外周血中CD3+CD4+IFN-γ+Th1 和CD3+CD4+IL-4+Th2 细胞百分比的影响 与AR 组相比，TP 组中CD3+CD4+IFN-γ+Th1 细胞的百分比升高（P＜0.05），CD3+CD4+IL-4+Th2 细胞百分比降 低（P＜0.01）（图4A-4B）。此 外，AR 组 中CD3+CD4+IFN-γ+Th1 和CD3+CD4+IL-4+Th2 细胞比例较Control 组下降（P＜0.01）（图4C）。

图4 雷公藤甲素对过敏性鼻炎大鼠外周血单个核细胞中CD3+CD4+IFN-γ+Th1 和CD3+CD4+IL-4+Th2 细胞百分比的影响

2.6 雷公藤甲素对TLR4/NF-κB 通路相关蛋白的影响 qPCR 和Western blot 结果表明，TP 组大鼠鼻黏膜组织中TLR4 和NF-κB mRNA 和蛋白表达较AR 组下调（P＜0.05）（5A-5C）。免疫组化结果显示，Control组大鼠鼻黏膜中几乎无棕黄色颗粒，AR 组大鼠鼻黏膜中可见大量棕黄色颗粒，表明TLR4 和NF-κB 的阳性表达升高，TP 组大鼠鼻黏膜中棕黄色颗粒较AR 组均明显减少，TLR4和NF-κB 的阳性表达下降（均P＜0.05）（图5D 和5E）。

图5 雷公藤甲素对TLR4/NF-κB 通路相关蛋白的影响

3 讨论

过敏性鼻炎是一种免疫疾病，由遗传和环境因素等引起[11]。过敏性鼻炎也是由免疫球蛋白E-（IgE-）介导的炎症诱导的I 型过敏性疾病，其特征在于HIS的释放[12]。过敏性鼻炎有多种合并症，如哮喘、结膜炎、头痛、鼻息肉、鼻窦炎和中耳炎[13]。

雷公藤（TWHF）用于治疗自身免疫性疾病和炎症[14]。雷公藤甲素TP 是雷公藤的主要活性成分，具有广泛的抗炎和免疫抑制作用，可有效减轻过敏性鼻炎中炎性细胞的浸润。

1 型辅助T（Th1）细胞和2 型辅助T（Th2）细胞的失衡被认为是IgE 介导的过敏性炎症的主要诱导因子[15-16]。当感染过敏性鼻炎时，分化成Th2 细胞的比例将明显增加，并且白细胞介素-4（IL-4）（主要由Th2 细胞释放）分泌显著增加以加速IgE 的产生并同时抑制干扰素-γ（IFN-γ）（主要由Th1 细胞释放）的释放，被称为Th1/Th2 失衡[17]。因此，Th1/Th2 的平衡在过敏性炎症中至关重要。本研究结果显示，AR 组大鼠血清中总IgE、HIS 和IL-4 的含量较Control 组明显增加，IFN-γ 的含量下降；TP 组大鼠血清中总IgE、HIS 和IL-4 含量较AR 组减少，IFN-γ 的含量增加。流式检测进一步显示与Control 组相比，AR 组中CD3+CD4+IFN-γ+Th1 细胞的百分比明显降低，CD3+CD4+IL-4+Th2 细胞百分比显著升高，与AR 组相比，TP 组中CD3+CD4+IFN-γ+Th1 细胞的百分比升高，CD3+CD4+IL-4+Th2 细胞百分比明显降低。提示AR 组大鼠Th1/Th2 比例在过敏性鼻炎中明显增加，且雷公藤甲素的干预逆转了Th1/Th2 比例，减少了机体的炎症反应。

Toll 样受体（TLR）广泛表达在呼吸道鼻黏膜的树突状细胞、黏膜上皮细胞表面，是天然的免疫受体。TLR4 在识别配体后，引发信号传导，从而导致炎症介质的释放，从而引发免疫应答反应[18]。研究显示，在季节性过敏性鼻炎患者鼻黏膜组织中TLR4呈高表达[19]。NF-κB是体内重要的核转录因子，存在于多种细胞中，参与炎症、免疫、细胞增殖和细胞凋亡等多种生理病理过程，是多种炎症介质的转录调节因子[20]。本研究结果表明，雷公藤甲素对TLR4/NF-κB 通路具有明显的抑制作用。