多层螺旋CT联合血清LncRNA UCA1检测在胆囊癌中诊断价值

杜 森 周 青 孙亮亮 刘 利 鲍志国

胆囊癌是一种常见的消化系统肿瘤，其起病隐匿、临床症状不典型，与胆囊炎难以区分，早期难以确诊，多数胆囊癌患者确诊时已错失手术最佳时机，影响预后［1］。因此，及早诊断胆囊癌对控制胆囊癌患者病情，延长患者生存时间尤为重要。多层螺旋CT（multi-slice spiral CT， MSCT）是诊断胆囊癌的重要手段，但有些胆囊癌患者的CT 征象并不突出，且螺旋CT 受炎症影响，从而影响胆囊癌的确诊率［2］。有关研究表明，影像学与血清指标联合可提高诊断胆囊癌的准确性［3］。研究发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA， LncRNA）在胆囊癌中异常表达，提示其可作为诊断胆囊癌的生物学指标［4］。LncRNA 尿 路 上 皮 癌 胚 抗 原1 （LncRNA urothelial carcinoembryonic antigen 1， LncRNA UCA1）是LncRNA 的一员，其在胆囊癌中表达上调，与患者预后相关，LncRNA UCA1 可能在胆囊癌发生发展中起促进作用［5］。基于上述研究，本文通过检测LncRNA UCA1 在胆囊癌患者中的表达水平，旨在探究MSCT 联合血清LncRNA UCA1 检测是否可有效鉴别胆囊癌患者，为临床早期诊断胆囊癌提供参考。

方 法

1.临床资料

选取2018年2月—2022年3月本院收治的胆囊癌患者74 例为胆囊癌组，男30 例，女44 例；年龄41～70 岁，平均年龄（55.64±11.33）岁。另选取同期诊治的慢性胆囊炎患者74 例为胆囊良性疾病组，男35例，女39 例；年龄41～70 岁，平均年龄（54.27±11.08）岁。胆囊癌组、胆囊良性疾病组年龄、男/女相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：①胆囊癌患者符合《胆囊癌诊断和治疗指南（2015版）》［6］中的诊断标准；②受试者经病理检查确诊为慢性胆囊炎、胆囊癌；③遵从《赫尔辛基宣言》中相关要求；④受试者检查资料均齐全；⑤受试者均无放化疗史。排除标准：①伴有其他恶性肿瘤者；②伴有严重肝肾功能障碍者；③处于妊娠/哺乳期者。

2.血样收集

收集受试者行MSCT 检查前外周血5～6 mL，静置30 min，4℃条件下，以4 800 r/min 转速离心5 min，分离血清后分装，-70 ℃保存。

3.MSCT检查

利用宝石CT 扫描仪（Discovery HD750，GE 公司）对所有受试者进行MSCT检查。受试者检查前禁食8～12 h，在检查前1 h 嘱咐受试者饮800 mL 温水，检测时受试者再饮500 mL 温水使膀胱、胃十二指肠充盈。受试者取平卧位，先平扫膈顶至胰腺平面，后进行增强扫描，经肘静脉注射碘海醇对比剂（注射剂量为1.5 mL/kg，注射速率为3.2～3.5 mL/s），由2名放射科医师对受试者进行MSCT 扫描，并判定病灶性质；其中慢性胆囊炎：其胆囊壁规则/性弥漫性增厚，胆囊壁柔软，增强扫描后均匀强化，胆囊黏膜线连续、完整，胆囊与肝脏等脏器有明显的界限；而胆囊癌：其胆囊壁表现为不规则增厚、僵硬，胆囊形态不规则，动脉期胆囊黏膜有显著强化，有时可出现周围组织受侵袭的征象。病灶图像判定标准如下：

（1）胆道梗阻：其中低位梗阻是胆总管下端表现为扩张，而高位梗阻是肝门以下肝管系统表现为扩张。

（2）胆囊壁僵硬：是指囊壁表现为僵直，其形态不规整，丧失正常轮廓。

（3）胆囊壁增厚及增厚方式：以胆囊壁最厚处的厚度超过3 mm 为增厚；另外，以最厚处与最薄处的胆囊壁厚度比值≥2∶1 且不连续性增厚为不规则性增厚，而以比值＜2∶1且均匀性增厚为规则性增厚。

（4）侵犯肝脏：肝脏胆囊床表现为模糊，且肝脏内出现斑片状低密度影，在增强扫描后呈现片状强化状态。

（5）胆囊黏膜线：增强扫描时，以＞ 90%层面黏膜线中断为黏膜线破坏/不完整，否则为完整。

4.实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）法检测血清LncRNA UCA1 表达水平

于冰上解冻适量血清，以TRIzol LS Reagent（10296-010，Ambion 公司） 提取RNA；利用MMLV first strand cDNA Synthesis Kit （TQ2501-01，OMEGA 公司）将RNA 进行反转录，获得cDNA；之后， 按 SYBR Green Realtime PCR Master Mix（CAL412，北京华越洋生物科技有限公司）、qRTPCR 仪（PikoReal，Thermo Scientific 公司）说明书扩增cDNA，读取循环阈值（CT 值）。扩增参数：98.6℃预变性6 min；96.2℃变性30 s，62.5℃退火20 s，72.5℃延 伸15 s，循 环40 次。GAPDH 是LncRNA UCA1 的内参，其中GAPDH 上游引物序列为5’-GCTGCAGA AGGTCCGAAGAA-3’，下游引物 序 列 为5’-TTCACCACGTCCAGTTGCTT-3’；LncRNA UCA1 上 游 引 物 序 列 为 5’ -GCTGCAGAAGGTCCGAAGAA-3’，下游引物序列为 5’ - GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG - 3’。LncRNA UCA1相对表达量以2-ΔΔCT法计算。

5.血 清 癌 胚 抗 原 （carcinoembryonic antigen， CEA）、 糖 类 抗 原125 （carbohydrate antigen 125， CA125）水平检测

常温下解冻适量血清，按全自动化学发光免疫分析仪（I2000，美国雅培公司）说明书检测受试者血清CEA、CA125水平，以血清CEA水平＜36.67 μg·L-1或血清CA125 水平＜88.87 U·mL-1为胆囊癌阴性。

6.联合检查

MSCT 检查、血清LncRNA UCA1 检测中若有一项或一项以上为胆囊癌阴性，则判定两项联合诊断胆囊癌为阴性。

7.统计学分析

数据使用SPSS25.0 软件分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。以例或%描述计数资料，行卡方检验；以±s表示计量资料，行t检验；以术后病理检查结果为金标准，MSCT 检查、血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 及MSCT 检查联合血清LncRNA UCA1诊断胆囊癌的价值以四格表分析；血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 诊断胆囊癌的价值以受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估。

结 果

1.2组患者MSCT征像比较

2 组患者均呈现胆囊壁增厚，且胆囊癌患者胆囊壁厚度为（9.76±3.25）mm，高于胆囊良性疾病患者的（4.64±1.45）mm（t=12.376，P＜0.05）。另外，与胆囊良性疾病组相比，胆囊癌组患者胆囊壁僵硬、胆囊壁不规则增厚、侵犯肝脏、胆囊边界不清、胆囊黏膜线不完整的占比均较高（P＜0.05）。见表1。

表1 2组MSCT征像比较（例）

2.MSCT 典型影像及MSCT 检查对胆囊癌的诊断价值

以胆囊癌患者术后病理检查结果为金标准，评估MSCT检查对胆囊癌的诊断价值。74例胆囊癌患者中有7 例漏诊，74 例胆囊良性疾病患者中有16 例误诊，MSCT 检查诊断胆囊癌的灵敏度为90.54%、特异度为78.38%、准确度为84.46%。见表2。MSCT 典型影像见图1。

表2 MSCT检查对胆囊癌的诊断价值（例）

图1 慢性胆囊炎及胆囊癌典型病例影像结果

表3 胆囊癌组、胆囊良性疾病组患者血清LncRNA UCA1、CEA、CA125水平比较n=74，± s

表3 胆囊癌组、胆囊良性疾病组患者血清LncRNA UCA1、CEA、CA125水平比较n=74，± s

组别CEA/(μg·L-1)CA125/(U·mL-1)胆囊良性疾病组胆囊癌组t值P值LncRNA UCA1 1.01±0.34 1.87±0.62 10.462＜0.001 23.63±10.74 54.04±24.56 9.759＜0.001 57.68±26.22 145.23±66.04 10.599＜0.001

表4 血清LncRNA UCA1、CEA、CA125对胆囊癌的诊断结果（例）

表5 MSCT检查联合血清LncRNA UCA1对胆囊癌的诊断结果（例）

表6 MSCT检查、血清LncRNA UCA1、CEA、CA125单项检测及联合检测的诊断效能比较

3.胆囊癌组、胆囊良性疾病组患者血清LncRNA UCA1、CEA、CA125水平比较

胆囊癌组患者血清LncRNA UCA1、 CEA、CA125 水 平 高 于 胆 囊 良 性 疾 病 组（P＜0.05）。见表3。

4.血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 水平对胆囊癌的诊断价值

血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 诊断胆囊癌的ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）分别为 0.894 （95%CI 0.838～0.950）、 0.664 （95%CI 0.577～0.751）、0.685（95%CI 0.599～0.770），截断值分别为1.48、36.67 μg·L-1和88.87 U·mL-1，灵敏度分别为89.19%、54.05%、55.41%，特异度分别为79.73%、56.76%、60.81%，准确度分别为84.46%、55.41%、58.11%。以血清LncRNA UCA1相对表达量＜1.48 或血清CEA 水平＜36.67 μg·L-1或血清CA125 水平＜88.87 U·mL-1为胆囊癌阴性。见图2、表4。

5.MSCT 检查联合血清LncRNA UCA1 评估胆囊癌的价值

以术后病理检查结果为金标准，判断MSCT检查联合血清LncRNA UCA1 诊断胆囊癌的价值，结果显示，MSCT 检查联合血清LncRNA UCA1 诊断胆囊癌的特异度、准确度（分别为95.95%、91.89%）明显高于MSCT 检查和LncRNA UCA1、CEA、CA125 单独诊断（P＜0.05），且其灵敏度（为87.84%）较高。见表5、表6。

图2 血清LncRNA UCA1、CEA、CA125诊断胆囊癌的ROC曲线

讨 论

胆囊癌早期不易被察觉，患者确诊时已处于中晚期，手术作为治疗胆囊癌的主要手段，其虽可一定程度延长胆囊癌患者寿命，但多数胆囊癌患者恶性程度较高，预后并不理想［7］。且胆囊癌发生发展与血管异常生成、LncRNA 表达失调、免疫逃逸等有关［5，8］。因此，寻找与胆囊癌病理发展有关，且可早期有效诊断胆囊癌的方法，对改善胆囊癌患者生存状态有积极意义。

MSCT 分辨率较高，其可清晰显示胆囊内结节、肿块、胆囊壁增厚等征象，可较准确地鉴别诊断胆囊癌［9-10］。本研究中胆囊癌患者胆囊壁僵硬占比、胆囊壁不规则增厚占比、侵犯肝脏占比、胆囊边界不清占比、胆囊黏膜线不完整占比较高，与张碧锋等［9］研究结果相似，表明MSCT检查可有利于临床鉴别胆囊癌与慢性胆囊炎。研究发现，MSCT 可显示胆管癌发生部位、范围，其诊断胆管癌的灵敏度为91.5%，特异度为72.7%，MSCT 对胆管癌有一定诊断价值［10］；而闵钢等［11］通过回顾性分析发现，以胆囊癌患者术后病理证实为对照，利用MSCT检查可正确诊断80%的胆囊癌患者。本研究显示，MSCT 检查诊断胆囊癌的灵敏度为90.54%、特异度为78.38%、准确度为84.46%，提示MSCT 检查对临床诊断胆囊癌有一定价值，术前行MSCT检查可有益于临床判定受试对象是否患有胆囊癌。本研究与闵钢等［11］研究结果略有差异，可能是由于受试者个体差异、影像学医生经验所造成的；另外，MSCT 检查诊断胆囊癌的诊断准确度较低，可能是因为慢性胆囊炎疾病患者与胆囊癌的MSCT征象难以鉴别。

LncRNA 是一类可稳定存在于血清的长链RNA分子，取材方便，易于检测，其可影响血管生成，介导相关信号转导，调节上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition， EMT）过程，与肝癌、胃癌、胆囊癌等发展过程相关，且LncRNA 具有诊断多种癌症的潜在价值［12］。既往研究发现，LncRNA UCA1 在肝细胞癌中表达上调，高水平LncRNA UCA1 与肝细胞癌不良预后密切相关，LncRNA UCA1 有望成为诊断肝细胞癌、评估预后的标志物［13］；而Zhang 等［14］研究发现LncRNA UCA1 在胆囊癌中呈过表达，敲低LncRNA UCA1 表达可抑制胆囊癌进展，LncRNA UCA1 可作为胆囊癌治疗靶点。本研究发现，胆囊癌患者血清LncRNA UCA1 表达水平 较 高，与Zhang 等［14］研 究 趋 势 一 致，提 示LncRNA UCA1 可能影响胆囊癌发生发展，推测LncRNA UCA1 可能通过调节胆囊癌细胞增殖、迁移等过程进而促进胆囊癌发展。进一步研究发现，血清LncRNA UCA1 诊断胆囊癌的AUC 为0.894，灵敏度为89.19%，特异度为79.73%，准确度为84.46%，提示检测血清LncRNA UCA1 水平有助于临床诊断胆囊癌，LncRNA UCA1 有望成为诊断胆囊癌的辅助指标。CEA、CA125均是糖链抗原，是诊断胆囊癌的传统标志物［15］。本文通过比较胆囊癌组与胆囊良性疾病组患者血清CEA、CA125 水平，发现胆囊癌组患者血清CEA、CA125 水平较高，与张阳等［15］研究结果类似，且CEA、CA125 诊断胆囊癌的AUC 分别为0.664、0.685，诊断价值较低，且两者诊断灵敏度、特异度均低于MSCT 检查、血清LncRNA UCA1 单独诊断。因此，本文通过将MSCT 检查与血清LncRNA UCA1 进行联合用于胆囊癌诊断，结果显示，MSCT检查与血清LncRNA UCA1联合诊断胆囊癌的特异度、准确度最高（分别为95.95%、91.89%），且灵敏度为87.84%，提示MSCT 检查、血清LncRNA UCA1 联合可提高诊断胆囊癌的特异度，升高诊断胆囊癌的价值，MSCT 检查联合血清LncRNA UCA1 有望成为一种诊断胆囊癌的可靠、有效方法，有一定临床参考价值。

综上，MSCT 检查联合血清LncRNA UCA1 可有效提高诊断胆囊癌的价值，有助于临床高效鉴别或诊断胆囊癌。但本研究样本较少且未进行预后随访，后续将增加研究样本数并进行远期预后随访，以便增加实验说服力。