达格列净对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞MKP-1表达的影响及意义

王丽晖,黄旭东,汪晶华,张 超,史永红,杨新军

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的严重并发症之一,在国外该病是导致慢性肾功能衰竭的首位原因。随着我国糖尿病发病率的升高,DN也逐渐成为国内慢性肾功能衰竭的主要原因之一。有研究表明,多种细胞因子参与DN的发病过程,结缔组织生长因子(CTGF)在DN早期肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质蛋白过度分泌过程中具有一定作用[1]。在高糖状态下肾小球系膜细胞CTGF的表达受p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的调节[2]。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)作为p38 MAPK磷酸化的调控因子,如何在肾小球系膜细胞CTGF表达和细胞外基质蛋白分泌过程中发挥作用,越来越受到研究人员关注[3]。MKP-1如何调节CTGF表达和系膜细胞分泌细胞外基质蛋白,目前尚无定论[4]。钠-葡萄糖共运蛋白2(SGLT2)抑制剂是一种新型降糖药物,还能够降低DN患者蛋白尿、延缓慢性肾功能衰竭的发生[5]。但是SGLT2抑制剂对DN保护作用的具体机制尚不清楚。本实验观察SGLT2抑制剂达格列净对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞MKP-1表达的影响及机制,明确MKP-1与CTGF表达和细胞外基质蛋白分泌的关系,以期为达格列净治疗DN提供更充足的理论基础和临床证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

达格列净(粉剂)由阿斯利康医药科技(北京)有限公司馈赠。北京中杉金桥生物技术有限公司负责辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG和羊抗兔IgG进口分装。兔抗大鼠MKP-1、CTGF多克隆抗体、SB203580购自Santa Cruz公司;兔抗大鼠p38 MAPK和兔抗小鼠p-p38 MAPK购自美国Cell Signaling Technology;RT-PCR试剂盒购自Promega公司;聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自美国Milipore公司;细胞上清液中CTGF和纤维连接蛋白(FN)的ELISA检测试剂盒购自苏州瑞诺德生物科技有限公司;Ⅳ型胶原放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所有限公司。

1.2 系膜细胞培养及分组

大鼠肾小球系膜HBZY-1细胞株购自武汉大学保藏中心,采取常规复苏、胰酶消化法进行传代培养。首先将细胞分为4组,正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖培养)、渗透压对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培养)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖培养)、达格列净干预组(30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L达格列净培养)。各组细胞均干预48 h后收集细胞,应用相应方法提取系膜细胞的蛋白质和RNA,同时将细胞上清液收集到EP管中待测。

1.3 达格列净对系膜细胞增殖影响

取对数生长期的系膜细胞,经胰酶消化后,吹打成单细胞悬液,接种于96孔板中,按照分组进行干预,观察4组培养12、24、48 h系膜细胞增殖情况。另外,观察不同浓度(0、1、10和20 μmol/L)达格列净分别与30 mmol/L葡萄糖培养48 h后,系膜细胞的增殖情况。干预结束的各组细胞中加入MTT试剂(5 g/L),继续培养4 h,然后分别加入DMSO,使用酶标仪观察波长490 nm各组的吸光度值。实验重复3次,取平均值。

1.4 Western blotting检测相关蛋白表达

用冷PBS液将系膜细胞洗2遍,随后加入细胞裂解液,进行冰浴、离心操作。取样本50 μg,采用Lowry法测定蛋白浓度,8% SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜。加入MKP-1、CTGF、p38 MAPK和p-p38 MAPK抗体,稀释比例为1∶200,4 ℃过夜。再次洗膜操作后分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000稀释)。洗膜,加ECL试剂。Western blotting检测条带采用ODYSSEY双色红外激光成像系统(美国LICOR公司)扫描,定量分析采用LabWorks 4.5(美国UVP公司),测定其吸光度值。

1.5 RT-PCR检测

采用Trizol试剂提取系膜细胞总RNA,总RNA含量和纯度应用紫外分光光度仪测定。cDNA合成应用逆转录酶催化。在Taq DNA聚合酶作用下以适量cDNA为模板进行扩增。扩增过程主要包括:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性50 s进入循环,58 ℃和56.9 ℃分别为退火温度,作用时间为60 s,72 ℃延伸8 min,循环30次。对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,应用美国UVP公司生产的凝胶图像分析系统进行分析,对电泳结果进行吸光度扫描。用目的基因与GAPDH吸光度的比值来表示各基因的相对表达量。不同基因引物序列见表1。

1.6 细胞上清液CTGF和细胞外基质蛋白测定

收集系膜细胞上清液,应用ELISA试剂盒检测CTGF和FN含量,应用放射免疫法检测Ⅳ型胶原的含量,检测步骤严格按试剂盒说明书操作。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 达格列净对系膜细胞增殖的影响

与正常对照组比较,高血糖组培养12、24、48 h系膜细胞增殖程度增强(P<0.05,P<0.01)。与高糖组比较,达格列净干预组培养24和48 h系膜细胞的增殖程度减弱(P<0.05)。见表2。0、1、10和20 μmol/L达格列净分别与30 mmol/L葡萄糖培养48 h后,系膜细胞吸光度值分别为0.642±0.031、0.437±0.021、0.456±0.023和0.445±0.022。与0 μmol/L达格列净比较,1、10和20μmol/L达格列净干预能减弱系膜细胞增殖程度(P<0.05)。

表2 4组系膜细胞不同时间点细胞增殖状况比较

2.2 达格列净对MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达的影响

与正常对照组比较,高糖组MKP-1蛋白表达降低,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.01)。与高糖组比较,达格列净干预组MKP-1蛋白表达升高,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表达降低(P<0.05)。4组p38 MAPK蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表3。

1.正常对照组;2.渗透压对照组;3.高糖组;4.达格列净干预组;正常对照组采用5.5 mmol/L葡萄糖培养,渗透压对照组采用5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培养,高糖组采用30 mmol/L葡萄糖培养,达格列净干预组采用30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L达格列净培养;MKP-1为丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1,CTGF为结缔组织生长因子,MAPK为丝裂原活化蛋白激酶。图1 达格列净对系膜细胞MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达的影响

表3 4组系膜细胞MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达比较

2.3 达格列净对系膜细胞CTGF和FN mRNA表达的影响

正常对照组、渗透压对照组、高糖组和达格列净干预组CTGF mRNA表达分别为0.21±0.02、0.22±0.02、0.78±0.24和0.59±0.02;FN mRNA表达分别为0.22±0.03、0.24±0.02、0.81±0.18和0.56±0.11。与正常对照组比较,高糖组CTGF和FN mRNA表达明显升高(P<0.05)。与高糖组比较,达格列净干预组CTGF和FN mRNA表达明显降低(P<0.05)。见图2。

1.正常对照组;2.渗透压对照组;3.高糖组;4.达格列净干预组;正常对照组采用5.5 mmol/L葡萄糖培养,渗透压对照组采用5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培养,高糖组采用30 mmol/L葡萄糖培养,达格列净干预组采用30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L达格列净培养;CTGF为结缔组织生长因子,FN为纤维连接蛋白;与正常对照组比较,①P<0.05;与高糖组比较,②P<0.05。图2 RT-PCR检测4组系膜细胞CTGF和FN mRNA表达

2.4 达格列净对细胞上清液CTGF及细胞外基质蛋白含量的影响

与正常对照组比较,高糖组细胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量明显增加(P<0.01)。与高糖组比较,达格列净干预组细胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 4组系膜细胞上清液中CTGF和细胞外基质蛋白含量比较

3 讨论

DN早期肾小球处于高灌注、高滤过状态,与之相对应的病理改变是肾小球体积增大、系膜细胞数量及细胞外基质蛋白分泌增多,随着病程的延长,最终导致肾小球硬化[5-7]。CTGF作为促纤维化因子,能够在糖尿病早期的细胞外基质蛋白分泌增多和晚期的肾脏纤维化过程中发挥作用[8]。有研究发现,CTGF mRNA在DN早期肾小球中表达增强,提示其参与了肾小球体积增大和细胞外基质蛋白分泌增多的过程[9]。另外,也有研究发现,DN大鼠肾小管上皮细胞CTGF表达增强,表明CTGF能够在DN肾小管增生和肾间质纤维化中发挥作用[10]。本实验在高糖状态下体外培养大鼠肾小球系膜细胞,观察到细胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量均明显增加,同时伴有系膜细胞CTGF蛋白和mRNA表达增强,提示高糖刺激可以通过增强CTGF蛋白和mRNA表达,进一步促进系膜细胞分泌细胞外基质蛋白。这与其他报道结果一致[11],表明高糖状态下CTGF表达的增加或与高糖、糖基化终末产物、高压力、肾素-血管紧张素Ⅱ信号转导通路激活等有关。

p38 MAPK信号转导通路在高糖等因素刺激下,可使体外培养的系膜细胞CTGF表达上调,细胞外基质蛋白分泌增加[12]。抑制p38 MAPK信号转导通路能够影响系膜细胞的增殖状态,使CTGF表达和细胞外基质蛋白分泌减少,从另一个侧面提示了p38 MAPK信号转导通路参与了高糖状态下CTGF表达和细胞外基质蛋白分泌[13]。本实验结果显示,高糖能使系膜细胞p38 MAPK的磷酸化水平增高,但MKP-1蛋白表达降低。由于MKP-1位于细胞核内,是MAPK的天然负性调节因子,对MAPK的去磷酸化发挥重要作用[14]。双特异性蛋白激酶磷酸化可以激活MAPK调节位点中保守的苏氨酸或酪氨酸基团,使其去磷酸化,从而使MAPK活性下降。所以,活化的MAPK在MKP-1作用下发生去磷酸化过程,导致活性下降。MKP-1的特异性选择底物是MAPK家族中的蛋白激酶,主要包括p38 MAPK、ERK1/2和JNK[15]。本实验结果显示,高糖状态下p38 MAPK可以作为MKP-1的底物,在MKP-1的作用下,去磷酸化过程减弱,p38 MAPK的活性增强,参与CTGF的表达和细胞外基质蛋白的分泌过程。以往实验发现,高糖培养大鼠肾小球系膜细胞MKP-1蛋白表达明显下降,而MKP-1 mRNA表达水平无明显变化,提示高糖并不能使MKP-1蛋白生成减少,但可致MKP-1蛋白降解增加[16]。本研究结果显示,与正常对照组比较,高糖组MKP-1蛋白表达降低,p-p38 MAPK蛋白表达明显升高,提示高糖状态下CTGF表达增强可能与MKP-1蛋白表达降低,p38 MAPK磷酸化增强,p38 MAPK活化有关。

SGLT2抑制剂是一种新型降糖药物,通过抑制肾脏近曲小管对葡萄糖的重吸收,使葡萄糖在尿液中的排泄增加,从而发挥降血糖作用[17-18]。另外,SGLT2抑制剂还具有肾脏保护作用,可以降低蛋白尿的发展和肾功能恶化的风险,其机制包括控制血压、降低肾小球内压和超滤、改变炎症过程、减轻肾脏纤维化及缺血相关的肾脏损伤等[19-21]。有实验研究表明,应用恩格列净治疗雄性db/db小鼠10周后,可以减轻FN和Ⅳ型胶原蛋白在肾小管的聚集,降低肿瘤转化因子、CTGF以及肾脏损伤分子-1、中性粒细胞明胶酶的表达[22],提示恩格列净可以减轻糖尿病小鼠肾组织的损伤和纤维化。在临床试验中,与格列美脲比较,卡格列净300 mg/d组血浆肿瘤坏死因子受体1、白细胞介素-6、基质金属蛋白酶7和FN1均明显降低,表明卡格列净可降低糖尿病患者血液中的纤维化因子[23]。上述研究均提示SGLT2抑制剂能减轻糖尿病患者肾组织细胞外基质聚集,降低纤维化因子表达,延缓肾脏纤维化进程。但SGLT2抑制剂对高糖状态下系膜细胞的作用如何,报道少见。本研究结果显示,与高糖组比较,达格列净干预组MKP-1蛋白表达升高,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表达降低,细胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量降低,提示达格列净可能通过增加MKP-1蛋白表达,使p38 MAPK去磷酸化水平增强,从而降低p38 MAPK活性,减少CTGF蛋白表达和细胞外基质蛋白分泌。进一步表明达格列净降低CTGF表达可能是通过增强MKP-1蛋白表达,抑制p38 MAPK信号转导通路实现的。

综上所述,达格列净可以有效抑制高糖培养肾小球系膜细胞CTGF表达和细胞外基质蛋白分泌,可能与激活MKP-1后,增强p38 MAPK去磷酸化有关。