miR-30b-5p通过下调MKRN3表达抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭

周乾华 毕华俊 孟凡东 施益明 芮超

安徽省第二人民医院胸心外科（合肥 230012）

食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一［1-2］。迄今为止，手术切除早期食管癌是提高患者存活率的主要方法［3-4］。许多患者被诊断出患有晚期肿瘤，这导致食管癌患者的治疗结果不佳［5-6］。因此，非常需要探索食管癌的分子机制，以开发治疗晚期肿瘤的有效疗法。microRNA（miRNA）属于一类进化保守的单链、小（约19～23 个核苷酸）、内源性表达和非蛋白编码RNA，在多种动物、植物和病毒中充当基因表达的转录后调节器［7-8］。近期多项研究表明miRNA 在癌症进展中发挥的作用。miRNA-30b-5p 是一种新的与癌症相关的诊断标志物。据报道［9］miR-30b-5p 可改善甲状腺癌的诊断。miR-30b-5p 通常作为肿瘤抑制剂，抑制癌症的增殖和转移，包括肾癌［10］、肺癌［11］和结直肠癌［12］。据报道，miR-30b-5p 通过调节自噬［13］、上皮-间充质转化（EMT）和mTOR 信号通路来控制肿瘤或疾病进展。通过生物信息网站TargetScan 预测显示MKRN3 是miR-30b-5p 靶基因，但是关于miR-30b-5p 和makorin，环指蛋白3（makorin ring finger protein 3，MKRN3）对食管癌调控的作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在讨论miR-30b-5p 靶向MKRN3 对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料收集2016 年1 月至2020 年12 月期间70 例食管癌患者的肿瘤和癌旁组织（距离肿瘤＞4 cm）的标本。纳入标准：（1）术前术后经过病理学诊断食管癌；（2）术前未经过放化疗治疗。排除标准：（1）非原发性食管癌及无法确诊食管癌的患者；（2）失访及预后信息不全者。根据患者信息电话随访，日期截止到2020 年12 月。患者组织利用低温保存固定后，进行石蜡包埋。并收集相关临床资料，包括年龄、性别、肿瘤分化、吸烟史、TNM 分期、淋巴结转移、远处转移、肿瘤位置、生存时间和预后结局。肿瘤组织经过两位病理学专家诊断为食管癌。本研究获得安徽省第二人民医院研究伦理委员会的批准，并且所有患者知情同意。

1.1.2 细胞培养和主要试剂人食管癌细胞（EC9706、TE-13 和ECA109）和人食管黏膜上皮细胞（HET-1A）购自中国科学院上海细胞库。使用10%胎牛血清（FBS）（Gibco）的1640 培养基（Gibco，CA）培养。培养基内含有10%的胎牛血清（Gibco）及1%青链霉素。细胞平时存放在37 ℃、含5%CO2的培养箱内培养。购买miR-30b-5p 模拟质粒和对照质粒购自上海吉凯公司。一抗（MKRN3、p-JAK、p-STAT3、JAK、STAT3 和GAPDH）均购自艾博抗公司，二抗购自于武汉三鹰生物科技有限公司，蛋白印迹试剂盒及BCA 蛋白浓度测量试剂盒购自碧云天生物技术公司，CCK8 检测试剂购买于上海生工生物有限公司。Transwell 小室及六孔板购自于NEST 公司。脂质体LipofectamineTM2000 转染试剂购于美国Invitrogen 公司；miRcule miRNA Isolation kit、miRcute Plus miRNA Qrcr Kit 和miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit 购买于中国天根有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染选择对数生长细胞，在转染前24 h 以每孔3.0 × 104个细胞的速度接种到6 孔板中。根据LipofectamineTM2000 转染试剂说明书，分别用过表达质粒和对照质粒转染ECA109 和TE-13细胞，标记为miR-30b-5p 模拟物和NC。在转染过程中，加入相应的试剂并混合均匀。将细胞培养基换成无血清培养基，在5%CO2和37 ℃的培养箱中培养6 h后换成新鲜培养基，然后进行后续实验。

1.2.2 qRT-PCR检测miR-30b-5p及MKRN3表达将转染程序结束后的细胞样本使用miRNA/mRNA试剂盒根据说明书步骤进行抽提miRNA/mRNA，将重提成功后取2 μg miRNA/mRNA 逆转录成cDNA，逆转录后取1 μL cDNA，使用购买的miR-30b-5p和其他相关引物进行PCR，记录每个反应管中荧光信号到达所设定阈值时所经历的循环数（Ct 值）。使用U6/GAPDH 作为内参分析miR-30b-5p 及MKRN3 的表达水平。通过2-ΔΔCt法计算相对表达量，见表1。

1.2.3 CCK-8 和克隆实验CCK-8 检测细胞增殖情况。待转染后ECA109 和TE-13 细胞接种于96孔板（NEXT 公司），以密度为5 × 103细胞/孔种板，培养一夜后。分别在培养0、24、48 和72 h 后，在避光的情况下每孔加入10 μL CCK-8 试剂，随后将96 孔板放入37.5 ℃的培养箱中培养大约1 h 后，在吸光度值OD450波段使用酶标仪检测OD值，以此检测细胞增殖情况。

克隆实验检测增殖情况，取转染好的细胞消化离心后，以1 000/孔的密度种植于6 孔板中，加入含10%的培养基，随后培养10 d。去上清后，加入4%的多聚甲醛固定30 min 后，加入1∶8 稀释后的结晶紫染液，染色30 min 后PBS 冲洗3～4 遍，拍照计数。

1.2.4 Transwell 实验检测迁移和侵袭能力将细胞以2 × 104个/mL 加入Transwell 中。将新鲜无血清DMEM 培养基加入到上室100 μL，将含有10%FBS 的DMEM 培养液加入到下室600 μL。48 h 后，用多聚甲醛固定下腔15 min，并用结晶紫染色10 min。在显微镜下，随机选择5 个高倍视野来计算迁移细胞的数量。实验前，将基质胶解冻，并在4 ℃下用DMEM 稀释。将基质胶加入Transwell 室中，在37 ℃的培养箱中干燥过夜，制备Transwell基质胶。将2×104个/mL 加入到室中，其余进行迁移实验以计算侵入细胞的数量。

1.2.5 双荧光素酶报道基因实验将对数生长期的实验细胞接种到96 孔板中。使用脂质体转染试剂盒共转染雷尼拉萤光素酶报告基因和miR-30b-5p 模拟片段。继续培养48 h 后，按照双荧光素酶试剂盒的说明进行操作。检测值的比率为比率（萤火虫萤光素酶值/海肾萤光素酶价值）。

1.2.6 裸鼠成瘤模型购买30 只BALB/c 雌性裸鼠（南京青龙山动物公司），年龄在4～6 周，随机分为NC 和miR-30b-5p mimics 组。将TE-13 和ECA109 细胞以5×107cells/mL（200 μL/小鼠）的浓度注射到小鼠的右腋下。3 周后，在小鼠体内注射100 nmol/L 转染试剂，持续2 周。每4 天，用卡尺测量肿瘤异种移植物生长，并根据以下公式计算体积：肿瘤体积（mm3）=（长度×宽度）2 × 0.5。30 d后，通过过量服用300 mg/kg 戊巴比妥钠对裸鼠实施安乐死。

1.2.7 Western blot检测相关蛋白表达收集相应细胞，购买碧云天公司RIPA 裂解液用以提取总蛋白裂解物。使用碧云天公司BCA 蛋白检测试剂盒进行测定蛋白浓度。待检测完成蛋白定量后，将等量配置好的蛋白质（40 μg）混合好上样缓冲液加载到凝胶上，在10%凝胶上电泳分离，然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用TBST 洗膜5 min/次共3次，用5%脱脂乳溶液封闭PVDF 膜1 h，然后将PVDF膜与一抗孵化，4 ℃孵育过夜。第2 天再次使用TBST 溶液清洗PVDF 膜3 次，再将PVDF膜与二抗在37 ℃下孵育1 h。

1.2.8 统计学方法本研究所有实验均独立进行3 次，数据以均值标准差（SD）表示。采用GraphPad prism 7.0 软件和SPSS 25.0 进行统计学检验。采用χ2检验评估BARX1 与临床病理因素的相关性。组间统计学比较采用t检验、单、双方差分析（ANOVA）。P＜0.05 为显著性结果。

2 结果

2.1 miR-30b-5p 在组织中的表达及与患者临床特征相关性为研究miR-30b-5p 在组织中的表达情况，本课题组收集我院70 例食管癌患者临床数据及组织标本。qRT-PCR 检测结果显示，与癌旁正常组织相比，miR-30b-5p 在食管癌组织中表达明显低于癌旁正常组织（P＜0.05），见图1。且根据qRT-PCR 结果显示，miR-30b-5p 表达水平与吸烟（P＜0.001）、分化程度（P=0.008）、肿瘤大小（P＜0.003）、TNM 分期（P＜0.002）、淋巴结转移（P=0.019）、远处转移（P=0.015）和位置（P=0.017）具有相关性（表2）。

图1 miR-30b-5p 在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平Fig.1 Expression levels of miR-30b-5p in esophageal cancer tissues and adjacent tissues

2.2 miR-30b-5p 和MKRN3 在食管癌细胞系中的表达Western blot 和RT-qPCR 实验室结果表明，与正常人食管黏膜上皮细胞HET-1A 比较，食管癌细胞ECA109、TE-13 和EC9706 中的MKRN3 表达量显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2A、B）。RT-qPCR 实验室结果表明，与正常人食管黏膜上皮细胞HET-1A 比较，食管癌细胞ECA109、TE-13 和EC9706 中miR-30b-5p 表达量显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2C、D）。由于ECA109 和TE-13 细胞中miR-30b-5p 表达较低，选择这二株细胞进行后续实验。

图2 miR-30b-5p 和MKRN3 在食管癌细胞系中的表达Fig.2 Expression of miR-30b-5p and MKRN3 in esophageal cancer cell lines

2.3 miR-30b-5p 表达上升后MKRN3 的表达水平与NC组（转染NC序列）比较，miR-30b-5p mimics组食管癌细胞株miR-30b-5p 表达水平显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3A）。不管是在蛋白水平还是mRNA水平，与NC组比较，转染miR-30b-5p mimics 组MKRN3 表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3B、C）。

图3 miR-30b-5p 表达上升后MKRN3 的表达水平Fig.3 The expression level of MKRN3 after the increased expression of miR-30b-5p

2.4 过表达miR-30b-5p 抑制食管癌细胞增殖、侵袭、迁移能力增殖实验CCK8 及克隆形成实验结果显示，与NC 组相比，miR-30b-5p mimics 组ECA109、TE-13 两株食管癌细胞增殖数量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05，图4A、B）。Transwell 小室实验结果显示，与NC 组相比，miR-30b-5p mimics 组ECA109、TE-13 两株食管癌细胞的迁移、侵袭能力显著减弱，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4C）。

图4 miR-30b-5p 对食管癌细胞增殖、侵袭、迁移能力影响Fig.4 Effects of miR-30b-5p on proliferation，invasion and migration of esophageal cancer cells

2.5 miR-30b-5p 靶向调控MKRN3 表达通过生物信息网站TargetScan 检索miR-30b-5p 的靶基因，可以发现多种与miR-30b-5p 存在靶向关系的基因。结果显示MKRN3 基因以原癌基因存在食管癌细胞中，并与miR-30b-5p 存在着靶向结合位点。本课题组将MKRN3 基因的3'UTR-WT 和miR-30b-5p 共转染后，相较于NC 组，miR-30b-5p mimics 组荧光素酶活性显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。3'UTR-MUT 和miR-30b-5p共转染后，相较于NC 组，miR-30b-5p mimics 组荧光素酶活性无明显差异，差异无统计学意义（图5）。这些结果说明，miR-30b-5p结合MKRN3 基因的3'UTR，进而达到抑制MKRN3 基因表达的作用。

图5 靶基因预测及双荧光素酶报告基因实验Fig.5 Target gene prediction and double luciferase reporter gene experiment

2.6 miR-30b-5p 抑制食管癌细胞体内增殖能力在ECA109 和TE-13 细胞株中转染miR-30b-5p mimic 后进行裸鼠成瘤实验，相较于NC 组，不论是ECA109 还是TE-13 细胞株，miR-30b-5p mimic 组显著抑制瘤体增殖（P＜0.05，图6）。

图6 miR-30b-5p 对食管癌细胞体内增殖影响Fig.6 Effect of miR-30b-5p on proliferation of esophageal cancer cells in vivo

2.7 miR-30b-5p 过表达抑制食管癌细胞JAK/STAT3信号通路通过Western blot 实验检测JAK/STAT3信号通路关键蛋白。Western blot 实验显示，与NC 组比较，miR-30b-5p mimics 组JAK、STAT3 蛋白水平差异无统计学意义，而p-JAK、p-STAT3 蛋白水平显著下降差异有统计学意义（P＜0.05，见图7）。

图7 Western blot 检测miR-30b-5p 对JAK/STAT3 信号通路的影响Fig.7 Western blot analysis of the influence of miR-30b-5p on the JAK/STAT3 signaling pathway

3 讨论

食管癌是一种侵袭性很强的恶性肿瘤，其癌症相关死亡率排名靠前［14-15］。我国是食管癌高发国家，全球约一半的食管癌新发病例在中国，其中食管鳞癌占90%［16］。食管癌的恶性增殖和抗凋亡是死亡的重要原因。因此，深入研究食管癌恶性表型的发病机制和具体分子机制，可为食管癌的早期诊断和预后评估提供新的可信赖的依据。miRNA 是基因表达的重要调节因子，其紊乱在癌症中起着至关重要的作用［17］。普遍认为miRNA肿瘤发生发展相关［18］。本研究中，我们在临床试验中检测了70 对食管癌组织和配对组织样本，以探索miR-30b-5p 的表达情况，并发现miR-30b-5p在食管癌中的表达下调。食管癌患者miR-30b-5p的低表达与吸烟、分化程度、肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移、远处转移和位置具有相关性。我们也发现miR-30b-5p 在食管癌细胞系中相较于食管黏膜上皮细胞也是低表达。这些研究结果均提示我们miR-30b-5p 在食管癌中可能是抑癌因素。

越来越多的研究［19-21］表明，大多数miRNA 通过抑制其表达水平来调节其靶基因。据报道，作为肿瘤抑制剂，miR-30b-5p 通过下调GNA13 的表达来调节肾癌细胞的增殖、转移和EMT。在结肠癌中，miR-30b-5p 通过靶向Rap1b 抑制转移［12］。miR-30b-5p 也可以抑制肝癌细胞系的增殖和细胞周期。此外，miR-30b-5p 通过靶向LRP8 抑制肺癌进展并增强顺铂敏感性。我们的研究结果显示，在体外实验中miR-30b-5p 可以显著抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在体内实验中，miR-30b-5p显著抑制瘤体增殖。Makorin，环指蛋白（MKRN3，makorin ring finger protein 3）是miR-30b-5p的下游靶基因，该基因编码的蛋白包含一个RING（C3HC4）锌指基序和多个C3H 锌指基序。在许多类型的癌症中发现了MKRN3 的异常表达，如MKRN3 通过PABPC1 和PABPC1 介导的全局蛋白来调节非小细胞肺癌细胞增殖［22］。此外，MKRN3 的潜在靶点P53 可能参与MKRN2 介导的食管癌的发生［23］。根据我们的实验结果，上调miR-30b-5p 表达，MKRN3表达量显著下降。同时，荧光素酶报告基因分析的结果表明miR-30b-5p 能够靶向作用于MKRN3的3'-UTR，抑制MKRN3 的表达。

信号通路在癌症发生发展过程中发挥重要作用。特别是JAK/STAT 信号通路的不当激活在人类癌症中频繁发生，并且与癌细胞的存活、增殖和转移有关［24］。最近，越来越多的证据［25-26］表明，JAK/STAT信号通路的异常参与了几种癌症的发生。已有研究表明，在食管癌细胞中阻断JAK/STAT 信号通路，可明显著抑制肿瘤细胞的侵袭迁移［27］。为了进一步探究miR-30b-5p 调控机制，我们通过蛋白印迹实验探索miR-30b-5p 调控食管癌的作用机制。结果显示p-JAK、p-STAT3 蛋白水平显著下降。因此我们认为miR-30b-5p 可能通过JAK/STAT 信号通路调控食管癌的发生发展。

综上所述，我们发现miR-30b-5p 在食管癌组织中低表达。过表达miR-30b-5p 可以通过下调MKRN3 抑制食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移。此过程可能通过JAK/STAT 信号通路调控食管癌的发生发展。因此，miR-30b-5p 表达可能为食管癌的临床诊疗及预后评估提供重要的参考价值。但在本研究中，我们未深入分析miR-30b-5p 对食管癌患者的预后影响及只注重体外研究实验，未对全部表型进行体内实验，这些都将是我们后续的研究重点。