乙酰肝素酶通过ERK/MMP-9信号通路促进胆囊癌细胞侵袭和迁移

常卫才 陈佳伟 刘子祥 陈正民 周少波

1蚌埠医学院第二附属医院（安徽蚌埠 233000）；2组织移植安徽省重点实验室（安徽蚌埠 233000）

胆囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是影响胆囊的最常见的胆道系统恶性肿瘤类型，病死率约1.7%，每年诊断出22 万例胆囊癌新发病例［1］。流行病学研究发现了许多与胆囊癌发病相关的危险因素［2］，如女性、年龄＞65 岁、长期胆结石伴慢性胆囊炎、先天性遗传变异、肥胖等。其中胆结石和慢性胆囊炎是胆囊癌发生发展重要的驱动因素［3-4］。隐匿发病，进展迅速，治疗选择有限，预后不良是胆囊癌主要临床特点［5］。目前手术切除加放化疗是胆囊癌唯一有望治愈的方法，但只适用于早期阶段的患者，大多数患者确诊时已是肝肺淋巴结转移的癌症晚期，失去了治愈机会［3］。近年来有研究表明乙酰肝素酶（HPSE）在胆囊癌组织中高表达，与患者的生存期短和不良预后密切相关［6］，但HPSE 影响胆囊癌侵袭、迁移表型改变的分子机制仍不清楚。

HPSE 是一种在哺乳动物体内普遍存在的内源性-β-葡萄糖醛酸酶，它的酶促活性可以水解切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素（HS）侧链，而非酶促活性可以调节细胞信号传导，这两方面的活性使它参与调节癌症进展的多个过程［7-8］，包括但不限于诱导自噬，改变肿瘤微环境，增强肿瘤细胞迁移和侵袭能力，促进肿瘤生长、分化及新生血管生成等。ERK/MMP-9 信号通路在肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭过程中发挥重要作用［9］。HPSE 可以调节肿瘤组织中MMP-9 的表达［10］，但涉及HPSE 与MMP-9 对胆囊癌侵袭、迁移的影响及作用机制有待研究。为此，在本研究中，我们在胆囊癌细胞模型中采用慢病毒转染方法建立HPSE 过表达和低表达的稳定细胞株，旨在明确HPSE 通过ERK/MMP-9 途径对胆囊癌细胞的迁移侵袭的影响，并分析其内在分子机制，以期为胆囊癌的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料人胆囊癌细胞系（GBC-SD）购自武汉普诺赛。慢病毒转染试剂盒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，细胞基础培养基（RPMI-1640）购自（北京）赛默飞世尔生物化学制品有限公司，胎牛血清购自Clark Bioscience，胰蛋白酶消化液购自Beyotime，青霉素-链霉素双抗购自Biosharp，Transwell 小室购自美国康宁公司，HPSE、MMP-9、GAPDH 多克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自abclonal，ERK、p-ERK 购于Proteintech；BCA 蛋白浓度定量试剂盒购自康为世纪；ERK 信号通路抑制剂SCH772984 购自MCE；Trizol、反转录试剂以及PCR 引物购自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、处理及分组将胆囊癌细胞系GBC-SD 置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的细胞基础培养基（RMPI-1640）中，在37 ℃和5%CO2浓度细胞培养箱中培养，细胞融合度约80%，胰蛋白酶将贴壁细胞消化脱落，1 000 r/min离心5 min；弃上清后，用完全培养基重悬细胞，移液枪重新吹打成均匀细胞悬浮液进行传代或种板。取生长状态良好的胆囊癌细胞，胰酶消化离心完全培养基重悬细胞，密度调整为1 × 105/mL，将2 mL 细胞悬液接种到6 孔板，细胞培养箱中培养24 h 后按照慢病毒转染操作说明书进行HPSE shRNA 转染和过表达转染，37 ℃和5%CO2浓度条件培养3 d，观察细胞荧光评价转染效果，qRT-PCR和Western blot 检测转染后GBC-SD 细胞中HPSE的mRNA 和蛋白表达水平。根据目的将实验分为阴性对照组（GBC-SD）、HPSE 基因过表达组（GBCOE）及HPSE 基因敲低组（GBC-SI）。

1.2.2 Western blot 检测HPSE、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表达收集生长状态良好的各组胆囊癌细胞，加入添加了蛋白酶抑制剂（PMSF）的细胞裂解液（RIPA）冰上裂解，超速离心，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白质样品与蛋白上样缓冲液混合（4∶1），100 ℃、10 min 使蛋白变性，10%SDS-PAGE 电泳，使用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜进行转膜操作，脱脂奶粉封闭2 h，PVDF膜置入HPSE（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体中4 ℃孵育过夜，之后TBST洗膜，置入相应的山羊抗兔二抗中室温摇床孵育2 h。TBST 再次洗膜，滴加适量的ECL 发光液，将PVDF 膜放入凝胶成像仪中曝光获取图像。

1.2.3 qRT-PCR 检测HPSE、MMP-9 mRNA 表达情况首先收集对数生长阶段的细胞，加入Trizzol溶液，提取细胞总mRNA，然后按照cDNA 合成试剂盒说明书中的操作步骤，将mRNA 反转为cDNA。以GAPDH 为内参，测定HPSE mRNA 的表达水平。根据GenBank 数据库中查询到的基因序列，应用Primer5.0 软件设计目的基因引物，由上海生工生物公司合成，引物序列见表1，利用2-△△Ct法进行了相对表达水平的测定。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

1.2.4 Transwell 实验检测细胞侵袭能力取对数生长期的细胞，将其种植在24 孔的平板小室内，在下室内添加了含有10%的胎牛血清的完全培养基，在37 ℃、5%CO2浓度的培养箱中培养24 h。然后，4 ℃预冷的PBS 洗2 遍，晾干之后多聚甲醛固定细胞30 min，再次晾干后用0.1%的结晶紫染液进行染色10 min。显微镜下随机5 个部位观察并拍照，计数取平均值平均。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力待各组细胞融合度约达80%时胰酶消化、离心，无血清基础培养基重悬，调整细胞密度为2.5×105个/mL，将细胞接种于6 孔板中，2 mL/孔，在37 ℃和5%CO2条件下培养至细胞融合。随后，使用200 μL 移液枪枪头尖端在单层表面上划痕，在培养0、24 h 时分别在划痕处随机选取5 个视野进行拍照以获取细胞迁移的图像。

1.2.6 数据分析运用GraphPad Prism 9.0 软件，进行统计分析及绘制图表，计量数据均使用均数±标准差来描述，使用t检验或方差分析来对各组之间的均数进行统计，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPSE 基因过表达和RNA 干扰抑制表达效果的验证Western blot 和qRT-PCR 实验结果显示，经转基因过表达HPSE 后的胆囊癌细胞中HPSE 的蛋白和mRNA 相对表达量较阴性对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；经RNA干扰抑制HPSE基因表达后的胆囊癌细胞中的HPSE mRNA 和蛋白相对表达量较阴性对照组降低（图1）。至此，HPSE 基因过表达组（GBC-OE）和HPSE 基因敲低组（GBC-SI）胆囊癌细胞株成功建立。并用于实施后续实验。

图1 慢病毒转染后胆囊癌细胞中HPSE mRNA 和蛋白表达情况Fig.1 Expression of HPSE mRNA and protein in gallbladder carcinoma cells after transfection with lentivirus

2.2 HPSE 对胆囊癌细胞行为功能学的影响划痕实验结果显示，与阴性对照组相比，HPSE 过表达组的细胞迁移能力明显增强，HPSE 敲低组结果则相反，见图2。Transwell 实验结果显示，与阴性对照组相比，HPSE 过表达组穿过基质胶的细胞数量显著增多，HPSE 敲低组情况相反，见图2。

图2 HPSE 表达水平改变对胆囊癌细胞迁移侵袭能力的影响Fig.2 Effect of HPSE expression on migration and invasion ability of gallbladder carcinoma cells

2.3 HPSE 对胆囊癌细胞中MMP-9 mRNA 和蛋白表达、p-ERK 和上皮间质转化相关蛋白表达的影响与对照组相比，HPSE 过表达组胆囊癌细胞中MMP-9 mRNA 和蛋白表达、p-ERK 及N-cadherin的蛋白表达水平呈升高改变，而E-cadherin 的蛋白表达水平呈降低改变；HPSE 敲低组MMP-9 mRNA和蛋白表达、p-ERK 及N-cadherin 的蛋白表达水平均呈降低改变，而E-cadherin 的蛋白表达水平呈升高改变，ERK 蛋白表达水平不受影响，见图3。

图3 HPSE表达水平改变后对MMP-9 mRNA和蛋白表达、EMT相关蛋白表达影响Fig.3 The effect of HPSE expression level on the expression of MMP-9 mRNA and protein，and the expression of EMT-related protein

2.4 HPSE 对胆囊癌细胞行为功能学影响的机制研究与HPSE 基因过表达组相比，胆囊癌细胞中HPSE 基因过表达+ERK 抑制剂组MMP-9、p-ERK、ERK、N-cadherin 的蛋白表达水平均呈降低改变，而E-cadherin 蛋白表达水平呈升高改变，见图4。

图4 HPSE 过表达胆囊癌细胞经ERK 抑制剂处理后对侵袭迁移相关蛋白表达的影响Fig.4 Effects of HPSE overexpression of gallbladder cancer cells on the expression of invasion migration-related proteins after treatment with ERK inhibitors

2.5 ERK 抑制剂对胆囊癌细胞行为功能学的影响与过表达组相比，胆囊癌细胞中HPSE 基因过表达+ERK 抑制剂组细胞穿过基质胶的细胞数量明显减少，见图5；与过表达组相比，胆囊癌细胞中HPSE 基因过表达+ERK 抑制剂组的细胞迁移能力明显减弱，见图5。

图5 ERK 抑制剂的处理显著逆转了了HPSE 过表达对胆囊癌细胞侵袭迁移能力的促进作用Fig.5 Treatment with ERK inhibitor significantly reversed the promoting effect of HPSE overexpression on invasion and migration of gallbladder carcinoma cells

3 讨论

胆囊癌是最常见的胆道系统恶性肿瘤，诊断不及时和治疗选择有限是胆囊癌治愈的主要障碍［11］。近年，虽然研究技术的快速进步为胆囊癌的治疗打开了新的窗口，出现了诸多新颖的诊疗策略，如特异性靶向治疗［12］、免疫治疗［13］、核酸分子诊断［14］和纳米粒子药物递送［15］等，但流行病学研究显示胆囊癌仍是最具侵袭性、中位生存期最短的胆道系统肿瘤［3］。因此，迫切需要了解胆囊癌进展的新的调控机制，以期改进治疗策略，提高患者生存期并改善预后。本研究在胆囊癌的治疗方面提供了可能有价值的分子靶点和理论支撑。

国内外大量研究表明，HPSE 表达水平与多种肿瘤类型的进展和预后密切相关［16-18］。RODRIGUES 等［19］的研究显示HPSE 在口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中表达上调，证明了HPSE 表达下调显著降低N-cadherin 和Vimentin 表达，进而诱导EMT并促进细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭。CHEN 等［20］发现HPSE 在肝细胞癌组织中高表达并与患者的多肿瘤病灶、微血管侵袭和不良预后相关。HPSE 抑制剂OGT2115 处理胆囊癌细胞，结果呈剂量依赖性抑制细胞生长与活性［21］。然而，HPSE 促进胆囊癌侵袭、迁移的完整机制仍有待阐明。

上皮间充质转化（EMT）是肿瘤侵袭转移发生的关键环节［22-23］，E-cadherin 的低表达以及N-cadherin 的高表达是EMT 发生过程中的重要分子标志。WANG 等［24］发现HPSE 活化Wnt/β-catenin通路，诱导EMT 从而促进胰腺癌的侵袭迁移。MASOLA 等［23］的研究证实HPSE 调节EMT 促进前列腺癌细胞侵袭迁移。ZAHAVI 等［25］采用体外细胞实验确认了EMT 相关基因高表达是过表达HPSE 促进乳腺癌进展的重要机制。我们由此推测EMT 的诱导是HPSE 促进胆囊癌细胞侵袭、迁移的重要步骤。另有研究表明，ERK 磷酸化与HPSE 的表达相关。在乳腺癌中，ZHANG 等［26］的研究发现干扰乙酰肝素酶表达降低ERK 磷酸化水平，抑制癌细胞的生长和转移。在肝癌中，YU等［27］的研究证明HPSE 诱导硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Syndecan-1）侧链的水解，促进与侧链结合的血管内皮生长因子C（VEGF-C）的释放，进而激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路促进淋巴管内皮细胞生长，改变肿瘤微环境利于肝癌细胞淋巴转移。ERK 的磷酸化已被证明参与调控肿瘤进展的多种生物学行为，如细胞增殖［28］、转移［29］、耐药［30］及免疫应答［31］等。在宫颈癌HeLa 细胞中，杨利利等［32］使用右美托咪定处理细胞后发现下调ERK 磷酸化水平诱导细胞凋亡并增强癌细胞对顺铂的敏感性。在肝细胞癌中，ZHAI 等［33］的研究揭示ERK 信号通路磷酸化激活后促进癌细胞增殖转移。MMP-9是ERK信号通路的下游分子［18，34］，是细胞外基质重塑的重要酶类，在胆囊癌细胞中高表达，且与肿瘤的侵袭、迁移密切相关［35］。显然，ERK/MMP-9 信号通路异常活化介导肿瘤细胞增殖存活、侵袭迁移［9，18，36］。

在此，为了探究HPSE 对胆囊癌细胞侵袭、迁移的影响及分子机制，我们采用转基因技术过表达HPSE 基因和RNA 干扰技术敲低HPSE 基因表达，再通过嘌呤霉素抗性筛选实验获得HPSE 过表达和低表达的胆囊癌稳定细胞系。接下来进行了Western blot 实验和qRT-PCR 实验验证转染后胆囊癌细胞中HPSE 表达，结果显示与GBC-SD 组细胞相比，转染后GBC-OE 组HPSE 蛋白和mRNA 相对表达量显著上调，GBC-SI 组情况相反。说明HPSE过表达和敲低表达的胆囊癌细胞系GBC-OE 和GBC-SI 成功构建。划痕愈合实验和Transwell 实验结果提示，HPSE 过表达促进胆囊癌细胞迁移、侵袭等恶性行为，而干扰HPSE 表达情况恰好相反。随后我们采用Western blot 实验和qRT-PCR 实验检测HPSE表达水平改变后可能相关的分子改变，结果与GBC-SD 组细胞相比，GBC-OE 组细胞中p-ERK、N-cadherin 蛋白及MMP-9 mRNA 和蛋白表达水平显著增加，而E-cadherin蛋白表达显著减少；GBC-SI组细胞出现了相反的情况。提示乙酰肝素酶上调ERK 磷酸化水平，增加MMP-9 表达并促进EMT 的发生。我们使用ERK 信号通路抑制剂SCH772984处理GBC-OE 组细胞进一步探究这些分子改变可能的机制，划痕愈合实验和Transwell 实验结果提示，HPSE 过表达对胆囊癌细胞侵袭迁移能力的促进作用在添加ERK 抑制剂后明显被逆转，同时Western blot 实验检测到在添加ERK 信号通路抑制剂后GBC-OE组细胞MMP-9、p-ERK和N-cadherin蛋白表达水平降低，E-cadherin 蛋白表达水平升高。因此认为HPSE 介导ERK 磷酸化上调导致MMP-9的表达增强和诱导EMT 的发生，进而增强胆囊癌细胞侵袭、迁移能力。

综上所述，改变胆囊癌细胞中HPSE 表达水平可以调控EMT 的发生并改变细胞的迁移侵袭能力，其机制可能是HPSE 通过调控ERK/MMP-9 信号通路实现的。本研究通过双向调节HPSE 表达不仅初步证实了HPSE 是胆囊癌细胞侵袭迁移的促进因素，还探究了其可能的分子机制，对胆囊癌发病机制进行了补充和丰富并为抗肿瘤药物的研发提供了理论依据。但该研究尚有不足之处，目前只在细胞水平上进行了初步的研究，后续本课题组还将继续通过敲低和过表达等方法，对其作用机制进行深入探讨，并在整体动物水平加以验证。