血浆外泌体PD-L1在胃癌中的表达及诊断价值

段瑞雪 杨斌 夏天红 阎龙 梁小芹 刘宏斌

1宁夏医科大学研究生院（银川 750004）；2甘肃省干细胞与基因药物重点实验室（兰州 730050）；3中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院普通外科（兰州 730050）；4甘肃省人民医院（兰州 730050）

胃癌（gastric cancer，GC）是常见的消化道恶性肿瘤，具有发病率高、病死率高等特点［1］。手术切除是提供治愈的一线治疗方法，早期胃癌5 年生存率可达90%［2-3］。因其起病隐匿，多数患者（70%）就诊时处于疾病晚期［4］。早发现、早诊断、早治疗成为提高胃癌治愈率、降低病死率的关键。程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）在各类细胞和组织中广泛表达，在促进肿瘤免疫逃避方面发挥重要作用［5］。临床PD-L1 检测通常采用组织活检，但其存在侵入性取样、肿瘤异质性、瘤体破裂和患者依从性差等限制。液体活检是从原发或远处肿瘤位置呈现疾病的快照，可用于肿瘤标志物的重复取样，被认为是比传统组织活检更为实用的动态监测方法［6］。外泌体是具有双层膜结构的细胞外囊泡，普遍存在于血液、尿液、胆汁、唾液等体液中［7］。研究表明癌细胞可以释放携带PD-L1 的外泌体［8］。外泌体PD-L1（exosome PD-L1，ePD-L1）与细胞表面PD-L1 具有相同的膜拓扑结构［9］，可直接与PD-1 结合诱导免疫抑制，从而抑制细胞毒性T 细胞功能，促使肿瘤免疫逃逸［10］。FAN 等［11］对1 例转移性胃癌患者血浆ePD-L1 进行分析后，发现其表达与免疫细胞数量呈负相关，可反映患者免疫抑制状态。本研究检测胃癌血浆和组织间隙ePD-1 的表达水平，分析其与胃癌发生、发展的关系，为胃癌的早期诊断和精准治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院2021 年12 月至2022 年12 月的40 例术后病理确诊胃腺癌的患者，同时选取20 例无心、肝、肾功能障碍且无原发恶性肿瘤的健康患者作为对照组。选取10 例癌组织和配对癌旁组织作为实验组和对照组。所有受试者样本采集均由本人或委托人签署知情同意书。本研究经中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院伦理委员会审批（编号：2021KYLL203）。

胃癌相关样本纳入标准：（1）患者在术前未进行新辅助治疗；（2）患者既往无恶性肿瘤、糖尿病和肝肾疾病等；（3）GC 患者的诊断标准采用《胃癌诊治指南》2022 年版；（4）纳入研究的患者组织由具有GC 诊断经验的病理学家通过标准苏木精和伊红染色切片进行组织学诊断；（5）样本新鲜且无污染，血浆样本储存-80 ℃，解冻后立即使用。组织样本离体后立即使用。

1.2 方法

1.2.1 血浆外泌体的提取收集胃癌和健康患者外周血，置于EDTA 抗凝管内。以300×g、2 000×g分别离心10、20 min。吸取上层血浆，以10 000×g离心30 min，去除残留细胞碎片。吸取上清转移至超高速离心管，PBS 配平后放入贝克曼超高速离心机以100 000 ×g离心1 h，倒去上清，PBS 重悬离心管底部，加入PBS 配平后再次以100 000×g离心1 h。倒去上清液并加入100 μL PBS 吹打充分混匀外泌体沉淀，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 组织外泌体的提取胃癌组织离体后立即放入填充PBS 的聚丙烯管，冰上转移至实验室。使用清洁镊子将组织转移至含有RPMI-1640 悬浮培养皿中，无菌手术刀将组织轻轻切成2 mm ×2 mm×2 mm 的小片段。培养皿中加入30 μL 胶原酶D 和4 μL DNase I，置于37 ℃恒温箱孵育30 min。通过70 μmol/L 过滤器过滤，将过滤液体以300×g、2 000 ×g分别离心10、20 min，以去除细胞和组织碎片。吸取上清配平后放入贝克曼超高速离心机以118 000 ×g离心2 h。PBS 重悬沉淀颗粒，置于-80 ℃储存。所有离心均在4 ℃下完成。

1.2.3 透射电子显微镜（TEM）室温条件下，移液枪吸取100 μL 重悬外泌体，向其加入2.5%戊二醛固定。在铜网上滴加10 μL 外泌体悬液，室温静置10 min，吸水纸吸取多余液体，吸取15 μL 的2%磷钨酸溶液滴加到铜网上复染处理3 min，然后置于白炽灯下孵育10 min 使外泌体悬液干燥。将铜网移至透射电镜样品槽内并观察外泌体大小及形态，获取电镜成像结果。

1.2.4 免疫印迹实验（WB）将血浆外泌体悬液和蛋白提取试剂RIPA 蛋白裂解液混合。BCA蛋白测定外泌体总蛋白浓度。采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳外泌体总蛋白，并电转到PVDF 膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h，用抗CD81、TSG101、HSP70、Calnexin 等一抗孵育过夜（4 ℃）。次日TBST 溶液漂洗3 次，并与二抗孵育60 min。TBST 溶液洗膜3 次。采用化学发光成像仪曝光显影。

1.2.5 ePD-L1 蛋白检测按照说明书配制洗涤稀释液、生物素化抗体工作液和酶结合物工作液。标准品依次稀释浓度为625、312.5、156.25、78.125 pg/mL。向酶标反应孔中加入100 μL 标准品稀释液和外泌体样本，封板后37 ℃恒温箱孵育90 min。洗板3 次。酶标反应孔中加入100 μL 生物素化抗体工作液，混匀封板后置于37 ℃恒温箱恒温孵育60 min。洗板4 次。酶标反应孔中加入100 μL 酶结合物工作液，混匀封板后置于37 ℃恒温箱恒温孵育30 min。洗板5 次。酶标反应孔加入100 μL 显色底物，混匀封板后避光显色15 min。加入50 μL 终止液。酶标仪读取450 nm波长下反应孔OD值，根据标准曲线自动计算ePDL1 浓度。

1.3 统计学方法借助SPSS23.0 和Graphpad prism 8.0 对数据进行处理。计量资料比较组间差异，采用两独立样本t检验、校正t检验或秩和检验。计数资料比较组间差异采用χ2检验、连续性校正χ2检验或Fisher's 确切概率法。两变量相关性采用Pearson相关性分析。绘制ROC曲线对ePDL1 的诊断价值与意义展开评价。

2 结果

2.1 外泌体的分离与鉴定TEM 观察血浆和组织间隙外泌体高度相似，均为“碟”状或具有双层膜的球形囊泡，囊泡边缘密度高，直径约30～120 nm（图1A、C）。WB 实验对外泌体膜特异性阳性蛋白标志物CD81、TSG101、HSP70 的表达及阴性蛋白标记物Calnexin 的表达进行测定（图1B、D）。

图1 A、C，血浆、组织外泌体TEM 成像；B、D，WB 检测血浆、组织外泌体标志蛋白Fig.1 A、C，TEM images of plasma and tissue exosomes；B、D，WB were used to detect exosome marker proteins in plasma and tissue

2.2 血浆和组织间隙ePD-L1 的表达情况血浆ePD-L1 表达水平在胃癌和健康对照组之间差异有统计学意义（P＜0.001），胃癌组表达水平显著高于健康对照组。胃癌组织ePD-L1 表达水平高于癌旁组织外泌体，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 ePD-L1 在胃癌血浆（A）和组织中的表达水平（B）Fig.2 Expression levels of ePD-L1 in plasma（A）and tissues of gastric cancer（B）

2.3 胃癌血浆和组织ePD-L1 表达相关性分析Pearson 相关性显示，血浆和组织ePD-L1 表达水平呈正相关（r=0.731 5，P=0.016 2），见图3。

图3 GC 血浆和组织PD-L1 相对浓度之间的相关性Fig.3 Correlation between plasma and tissue relative concentrations of PD-L1 in GC

2.4 胃癌血浆ePD-L1 的表达与临床病理特征的关系ePD-L1 表达水平与CA19-9、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、pTNM 分期等显著相关（P＜0.05）。与年龄、性别、BMI、CEA、分化程度、远处转移等无明显相关性（P＞0.05）。见表1。

表1 血浆ePD-L1 表达和胃癌患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between plasma ePD-L1 expression and clinicopathologic features in patients with gastric cancer 例（%）

2.5 组织ePD-L1的表达水平与临床病理特征的关系Ⅲ、Ⅳ期组织ePD-L1 的表达显著高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.01），此外，组织ePD-L1 的表达与淋巴结转移、远处转移、浸润深度、肿瘤大小等有相关性（P＜0.01），但与分化程度无相关性（P=0.67）。见图4。

图4 胃癌组织ePD-L1 的表达水平Fig.4 Expression level of ePD-L1 in gastric cancer

2.6 血清CEA、CA19-9 和血浆ePD-L1 表达对胃癌的诊断价值ROC 曲线分析显示血清CA19-9、CEA 的AUC 分别为0.676、0.758，ePD-L1 的AUC 为0.796（95%CI：0.658～0.935，P＜0.001），具有较好的灵敏度（表2）。三者联合用于诊断GC 的曲线下面积为0.905，灵敏度为75%，特异度为90%（图5）。

表2 ePD-L1、CA19-9、CEA 的诊断效能Tab.2 Diagnostic efficacy of ePD-L1，CA19-9 and CEA

图5 ROC 曲线分析CA19-9、CEA、ePD-L1 对GC 的诊断效能Fig.5 ROC curve analysis of the diagnostic efficiency of CA19-9，CEA and ePD-L1 for GC

3 讨论

外泌体是近年来兴起的一种纳米级细胞囊泡，其携带丰富的生物学信息，释放后可与受体细胞结合参与细胞内信号传导，影响受体细胞的生理功能［12］。随着对外泌体的不断深入了解，发现其通过致癌蛋白和核酸参与了肿瘤发生、进展、转移、血管生成、免疫逃避及肿瘤耐药［13-15］。其中外泌体对肿瘤免疫的影响引起学者关注，肿瘤细胞释放的外泌体将局部免疫抑制特性传播到整个肿瘤微环境中，并参与建立转移性生态位［16］。肿瘤来源的外泌体富含PD-L1，其表达水平与肿瘤分期、免疫治疗的反应性和预后显著相关［17-19］。LI等［20］对非小细胞肺癌患者血浆ePD-L1 进行分析后发现，其表达水平与肿瘤大小、淋巴结状态、转移和pTNM 分期显著相关。本研究中血浆ePD-L1也被证明在胃癌的发展过程中具有一定作用，我们发现胃癌血浆ePD-L1 表达水平高于健康对照组，其表达与CA19-9、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度和pTNM 分期等临床病理特征显著相关。进一步通过ROC 曲线分析发现，血浆ePD-L1 用于诊断GC 的曲线下面积为0.796。CA19-9、CEA 的AUC 值分别为0.676 和0.758，可以看出，ePD-L1 对于胃癌的诊断效能优于CEA 和CA19-9。此外，三者联合诊断胃癌的最大AUC 值为0.905，特异度和灵敏度分别为90%和75%。

肿瘤微环境是以肿瘤细胞为中心的动态生态系统［21］，组织间隙外泌体在肿瘤微环境信号传导发挥重要作用［22］。CRESCITELLI 等［22］在结肠癌组织切片中发现细胞与细胞缝隙中存在大量形态不同的外泌体。在本研究中，我们使用组织解离和差速超速离心的方式分离出组织间隙外泌体，并检测出癌组织间隙ePD-L1 的表达水平高于癌旁组织间隙。Pearson 相关性分析显示血浆ePD-L1与组织ePD-L1 的表达呈正相关升高。由此，我们可以推断GC 血浆ePD-L1 可能来源于组织间隙ePD-L1。

总而言之，ePD-L1 在胃癌患者血浆和组织中表达均升高，其表达与胃癌临床病理特征相关，可能参与胃癌进展。因此可作为胃癌可靠诊断生物标志物。