基于网络药理学探讨加味通窍活血汤治疗瘀血阻窍型后循环缺血的作用机制*

张道培,刘梦琳,张怀亮

河南中医药大学第一附属医院/河南省眩晕病诊疗中心/河南省中医药大学眩晕病研究所,河南 郑州 450000

后循环缺血(posterior circulation ischemia,PCI)是缺血性脑血管病的常见类型,约占缺血性脑血管病的20%[1-2]。由于PCI常见临床症状以头晕/眩晕为主,故多参照中医学“眩晕”病范畴进行辨病辨证[3]。历代医家对于眩晕的病因病机论述颇多,主要有因风、因痰、因虚、因火、因瘀5个流派,为后人从不同的角度认识和治疗眩晕提供了丰富的经验[4]。后循环血管解剖结构复杂,行程较长且变异多,是中西医结合从瘀论治PCI的病理生理基础。

通窍活血汤出自王清任的著作《医林改错》,是活血化瘀的名方,全方由赤芍一钱、川芎一钱、桃仁三钱、红花三钱、老葱三根、鲜姜三钱、红枣七个、麝香五厘(绢包)组成,用黄酒半斤煎煮服用,具有活血化瘀、通窍活络的功效,现代临床常用此方治疗瘀血阻窍型脑血管病。本课题组在原方的基础上加全蝎入络,石菖蒲豁痰,葛根引药上行组成加味通窍活血汤来治疗瘀血阻窍型PCI取得了较好的临床疗效[5],但其作用机制有待进一步阐释。此项研究旨在通过网络药理学的方法探讨加味通窍活血汤治疗瘀血阻窍型PCI的可能机制和潜在靶点,为PCI的中医药研究和治疗提供依据与参考。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分和靶点的筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索加味通窍活血汤组方中药麝香、川芎、赤芍、桃仁、红花、全蝎、石菖蒲,葛根、老葱、生姜、大枣的化学成分,筛选出口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,且类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18的活性成分及其相关靶点。基于Uniprot KB(http://www.uniprot.org/)数据库,借助Perl软件对中药有效成分对应的靶点进行注释。

1.2 疾病靶点的筛选利用Genecards(https://www.genecards.org/)数据库及在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)检索“posterior circulation ischemia”,查找PCI相关靶点,并进行整合去重。

1.3 蛋白互作网络构建通过VENNY2.1软件对中药有效成分相关靶点和疾病相关靶点取交集,将获取的交集靶标导入String11.0(https://string-db.org/)中,构建蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks,PPI)。

1.4 筛选核心基因将获得的交集基因导入String11.0中,下载PPI网络的tsv文件,并导入到Cytoscape3.7.2软件中,利用CytoHubba插件筛选核心靶点。

1.5 构建“中药-成分-靶点”网络将中药名称、药物有效成分、基因靶标等相互之间的关系网络信息导入到Cytoscape3.7.2软件进行可视化分析,构建“中药-成分-靶点”网络图并分析。

1.6 富集分析将核心靶点基因ID借助R软件和Bioconductor(http://www.bioconductor.org)数据库的工具包进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析。GO功能富集分析选择P<0.05的条目进行功能注释,根据富集程度均筛选前20个条目绘制成柱状图;同样选择P<0.05为显著性通路途径进行聚类分析,根据富集程度筛选前20个条目绘制成气泡图。

1.7 分子对接从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载核心成分的2D结构,通过ChemBio3D 2014软件将其能量最小化,并把2D结构转换为3D结构。从PDB数据库(http://www.rcsb.org)下载关键靶蛋白3D结构。利用Pymol软件对靶蛋白受体分子进行去水、去配体小分子等处理,再使用Autodock Tools 4.2.6软件对靶蛋白受体分子进行加氢等处理,通过Autodock Vina进行分子对接,并用Pymol软件进行3D展示。

2 结果

2.1 中药活性成分及靶点通过TCMSP数据库检索加味通窍活血汤组方中药川芎、赤芍、桃仁、红花、石菖蒲、葛根、老葱、生姜、大枣的化学成分,筛选符合OB≥30%、DL≥0.18的中药活性成分,其中川芎7个、赤芍29个、桃仁23个、石菖蒲4个、红花22个、葛根4个、老葱6个、生姜5个、大枣29个活性成分;通过文献检索补充麝香与全蝎的主要成分,其中麝香的主要有效成分麝香酮未能在TCMSP数据库中检索到,在PubChem数据库中下载麝香酮的3D结构,利用ParmMapper数据库基于麝香酮的药效团模型预测其作用靶点。通过TCMSP数据库获取活性成分相关靶点并借助Uniprot KB数据库和Perl软件进行注释后共获得加味通窍活血汤相关靶点289个。加味通窍活血汤的部分有效成分信息如表1所示。

表1 加味通窍活血汤部分有效成分信息

2.2 疾病相关靶点在Genecards数据库检索“posterior circulation ischemia”查找到PCI相关靶点1 997个,计算相关性评分的中位数,保留相关性评分≥中位数的疾病靶点;检索OMIM数据库获得疾病靶点52个,整合去重后共得到疾病相关靶点 1 044 个。

2.3 PPI网络通过VENNY2.1软件对中药活性成分靶点和疾病相关靶点取交集,共获得了131个交集靶点。将获取的交集靶点靶标导入String11.0(https://string-db.org/)中,选择“multiple proteins”,物种选择“homo sapiens”,中等置信度设为0.40,以构建相关PPI网络。见图1。

图1 韦恩图和PPI网络

2.4 核心基因将131个交集靶点导入String11.0中预测PPI网络后,剔除1个孤立节点,下载tsv文件导入Cytoscape3.7.2软件中进行网络分析,根据Degree值筛选出排名前20位的靶标,见图2;利用CytoHubba插件,基于MCC算法筛选出10个核心基因,如图3所示。

图2 Degree值排名前20位的靶点

图3 加味通窍活血汤治疗PCI的核心靶点

2.5 “中药-成分-靶点”网络将中药成分及靶点等相互作用关系的信息导入Cytoscape3.7.2软件中进行可视化分析,构建“中药-成分-靶点”网络图,如图4所示;该网络共包括207个节点(10个中药名称节点、64个化合物成分节点、131个基因靶标节点、1个方剂名称节点、1个疾病名称节点)和 669条边,红色菱形代表方剂名称、紫色矩形代表中药名称、椭圆形代表有效成分(其中橘色椭圆形代表多种中药共同含有的成分)、绿色矩形代表基因靶标、蓝色矩形代表疾病名称。网络分析显示,度值排名前10位的化合物分别为槲皮素(MOL000098)、17-β-雌二醇(MOL010919)、木犀草苷(MOL000006)、山柰酚(MOL00422)、β-谷甾醇(MOL000358)、黄芩素(MOL002714)、β-胡萝卜素(MOL002773)、芒柄花黄素(MOL000392)、豆甾烯醇(MOL000449)、杨梅酮(MOL002135),见表2,其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、黄芩素、β-胡萝卜素、豆甾烯醇均来自加味通窍活血汤中的多种中药。

图4 “中药-成分-靶标”网络图

表2 度值排名前10位的活性成分

2.6 富集分析通过R软件及Bioconductor数据库中的clusterProfiler、enrichplot等工具包进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析是对基因和蛋白质功能进行限定和描述的,分为生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组成(cellular component,CC)3个部分,每一类从不同的层面进行基因解释,颜色越深表示富集越显著。GO分析结果显示,BP主要与对氧气水平下降的反应(response to decreased oxygen levels)、对缺氧的反应(response to hypoxia)及对氧化应激的反应(response to oxidative stress)等生物过程密切相关;MF主要与细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、磷酸酶结合(phosphatase binding)、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)等相关;CC主要涉及膜微区(membrane microdomain)、受体复合体(receptor complex)、囊泡腔(vesicle lumen)及转录因子复合体(transcription factor complex)等。如图5所示。

图5 GO功能富集分析

对获得的靶标进行KEGG通路富集分析,选P值较小、富集程度高的20条通路进行可视化,见图6气泡图。涉及的信号通路主要包括脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、IL-17 信号通路、TNF信号通路及细胞凋亡(apoptosis)和癌症相关信号通路等。

图6 KEGG 通路富集分析气泡图

2.7 分子对接通过对“中药-成分-靶标”网络的分析及文献查阅,选择槲皮素、木犀草苷、山柰酚、麝香酮、17-β-雌二醇、β-谷甾醇作为核心成分,分别与核心靶蛋白HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)进行分子对接,见表3。结合能越低代表受体与配体的亲和力越好,选取结合能≤-5.0 kJ·mol-1作为化合物与靶点有效结合的筛选依据,将每个核心靶蛋白受体分子对接活性最强的化合物通过Pymol软件进行展示,见图7。

表3 核心成分与靶蛋白的结合能 (kJ·mol-1)

3 讨论

PCI的主要病因是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),在AS病变过程中始终伴随着血管重塑(vascular remodeling,VR)[6]。VR的机制可能与血流动力学刺激、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)改变、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖、凋亡、迁移及炎性反应损伤等有关[7],其中VSMCs的增殖、迁移、表型转化以及凋亡是VR的中心环节[8]。通窍活血汤是广泛应用于预防和治疗脑血管疾病的中药经典方剂,本课题组通过临床观察发现,加味通窍活血汤可明显改善瘀血阻窍型后循环缺血患者的临床症状,改善患者的后循环血流动力学参数[7],提示加味通窍活血汤可能影响后循环的血管重塑,但加味通窍活血汤发挥临床疗效的确切分子途径尚不清楚。

本研究检索出加味通窍活血汤的主要活性成分是槲皮素、17-β-雌二醇、木犀草苷、山柰酚、β-谷甾醇、黄芩素、β-胡萝卜素等。研究发现,槲皮素可有效抑制VSMCs增殖,并抑制胶原的合成和分泌,其机制可能与槲皮素可激活磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信号通路,上调磷酸化PI3K及Akt表达水平,进而抑制NF-κB向核内转运有关[9];也有研究表明,槲皮素可抑制凝血酶诱导的大鼠VSMCs增殖和迁移,其机制可能与抑制ERK1/2和p38磷酸化有关[10]。实验研究发现,槲皮素能够抑制ox-LDL诱导的VSMCs钙化及细胞炎症因子分泌[11],还可抑制ox-LDL诱导的人脐静脉VSMCs分泌MMP-2和MMP-9,这可能是槲皮素参与抗动脉粥样硬化的途径之一[12]。研究发现,17-β-雌二醇(17-β-estradiol,17-β-E2)可通过上调Bax蛋白表达而诱导VSMCs凋亡[13];17-β-E2能下调血管壁组织的NF-κB和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达,抑制血管壁的炎症反应[14-15];另外,17-β-E2可起到一定的促进血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)自噬的作用[16]。木犀草苷是一种黄酮类化合物,具有抗氧化和清除自由基的能力,可以保护VECs免受铁过载损伤[17]。山柰酚-3-O-芸香糖苷能抑制VSMCs的增殖和迁移[18];且山柰酚对炎症状态下的VECs具有显著的保护作用[19]。β-谷甾醇可通过抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎性小体NLRP3的激活来抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的活化,减少细胞中 NF-κB、IL-1β的生成,从而达到抗炎作用[20];还可通过影响巨噬细胞一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生及iNOS等炎症介质的表达进而使VCAM-1的表达下调,阻止 THP-1 单核细胞与血管平滑肌细胞的黏附起到改善AS的作用[21-22]。麝香酮可通过稳定线粒体膜电位,减少Ca2+内流,从而抑制过氧化氢诱导的人VECs的凋亡[23];还可通过抑制P-糖蛋白和MMP-9的表达改变体外血脑屏障模型的通透性[24]。黄芩素能明显抑制高糖导致的VSMCs从收缩表型到合成表型转化[25];还可抑制VSMCs的增殖并促进其凋亡[26]。β-胡萝卜素对高糖诱导的内皮细胞损伤有保护作用[27]。综上,加味通窍活血汤药效成分可能通过抑制炎症介质的表达保护血管内皮,抑制VSMCs的增殖和迁移,从而改善动脉硬化和血管重塑治疗PCI。

从核心靶点的角度进行分析,HIF-1是缺氧条件下表达的最重要因子,包括功能亚基α和组成性表达的β亚基,HIF-1α仅在缺氧条件下稳定表达,和EGF、血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor,PDGF)等共同协调VEGF的表达[28-29];当脑血管出现血流动力学障碍,脑组织缺血缺氧可诱导HIF-1α表达,进而激活VEGFA/VEGFR2信号通路,该信号通路在缺血性脑血管病中参与AS和新生血管生成等病理生理过程。IL-1β 主要是由外周血单核细胞、巨噬细胞和脑小胶质细胞合成,作为促炎细胞因子在炎症反应中发挥重要调控作用[30]。MMP-9属于锌依赖性蛋白水解酶家族,其来源于巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和上皮细胞等多种细胞类型,TNF-α和白细胞介素等炎症因子可以刺激MMPs的表达;反过来,MMPs降解ECM,促进炎症细胞、细胞表面受体和其他非ECM分子等细胞的迁移和募集,介导参与细胞黏附、增殖和凋亡等炎症过程;MMP-9的升高与多种疾病状态有关,如在动脉粥样硬化斑块中,基底膜降解导致炎症细胞募集和纤维帽破裂,进而导致斑块不稳定和破裂[31-32]。另外,剪切应力和动脉压力等血流动力学的改变也可以调节MMP的表达,参与血管重构,低流体剪切应力诱导的MMP-9表达与MAPK或ERK1/2/NF-κb信号通路有关[33]。

本研究KEGG通路分析发现,靶点主要富集在脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、MAPK信号通路、IL-17信号传导途径、TNF信号传导途径及细胞凋亡等信号通路。低流体剪切力可下调VSMCs的机械敏感性阳离子通道Piezo1而激活IL-1β介导的炎症反应,诱导VSMCs的增殖和迁移[34]。MAPK是一类重要的细胞内信号转导物质,能将细胞外信号转导至细胞核,以应对各种不同的刺激(包括细胞增殖、炎症反应及应激反应等),MAPK信号传导级联包括ERK1/2(细胞外信号调节激酶)、JNK(c-jun N末端激酶)和p38(p38蛋白)3种不同的途径。有研究已证明,MAPK在缺血性脑血管病的各阶段均可被激活,表达水平发生改变,并可能产生神经保护作用[35];ERK1/2的激活常保护神经元减少凋亡,p38和JNK的升高可导致神经细胞死亡[36]。MAPK通路和NF-κB的激活与VSMCs中VCAM-1的表达有关[37],可通过脑血管内皮细胞中的p38和JNK激活刺激VCAM-1的表达[38]。因此本研究推测,VEGFA/VEGFR2信号通路、MAPK信号通路、MMPs信号通路以及VSMCs介导的血管重塑是加味通窍活血汤治疗PCI的重要通路。

为了进一步验证加味通窍活血汤治疗PCI的药效物质基础,本研究对加味通窍活血汤的主要成分与核心靶蛋白进行了分子对接。分子对接结果显示,槲皮素和木犀草苷与VEGFA、MMP-9、HIF-1α、IL-1β 结合性较高,山柰酚与VEGFA、MMP-9、HIF-1α的结合性较高,17-β-雌二醇与VEGFA和MMP-9的结合能性较高;结合以上对药效成分的分析,说明加味通窍活血汤中通过调节VEGFA、MMP-9、HIF-1α、IL-1β等靶点发挥药效作用的主要成分为槲皮素、木犀草苷、山柰酚和17-β-雌二醇。另外,值得注意的是,作为受体蛋白的 MMP-9 与槲皮素、木犀草苷、山柰酚的结合性均较高,提示加味通窍活血汤对MMP-9的调节可能在瘀血阻窍型PCI的治疗中发挥重要作用。

综上所述,加味通窍活血汤中的槲皮素、17-β-雌二醇、木犀草苷、麝香酮、黄芩素等有效成分可能通过作用于VEGFA、EGF、HIF-1α、MMP-9、IL-1β 等核心靶点调节血管壁的炎症反应、VSMCs的增殖、迁移及VECs的损伤和凋亡等,延缓血管重塑,促进血管新生,从而对瘀血阻窍型PCI患者起到改善循环和神经保护的作用。本研究只是从理论上对其进行探讨,其结果有待于进一步基础实验验证。