颐脑解郁方对抑郁大鼠行为学和NLRP3相关炎性蛋白的影响*

张双,李江林,赵瑞珍,张东枢,李骁群,唐启盛

1.北京中医药大学,北京 100029; 2.北京中医药大学第三附属医院,北京 100029

抑郁症发病机制复杂,近年来抑郁症炎症假说得到越来越多证据的支持,有望成为抑郁症研究的突破点。研究表明,抑郁症患者血液中白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)等促炎因子水平明显升高[1],而抗炎治疗可以改善抑郁症状[2]。进一步研究发现,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)是IL-1β成熟和释放的诱导剂,同时是介导细胞焦亡的重要分子,NLRP3通过多种机制参与抑郁症的发生[3]。研究发现,NLRP3基因敲除的小鼠经4周慢性温和应激(chronic mild stress,CMS)无抑郁样表现,IL-1β和细胞焦亡执行蛋白gasdermin D(GSDMD)水平未见升高[4],据此推测NLRP3介导的免疫通路在抑郁症的发病中发挥着重要作用。

颐脑解郁方是唐启盛教授多年临床经验的总结,临床研究表明,颐脑解郁方起效快、安全性好[5-6],但颐脑解郁方是否通过抑制NLRP3的激活而产生抗抑郁作用仍然未知。因此,本研究通过检测大鼠血清中IL-1β、IFN-γ的表达情况以及脑组织中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白、GSDMD蛋白水平探索颐脑解郁方益肾调气的分子机制。

1 材料

1.1 实验动物SPF级健康雄性Wistar大鼠32只,6周龄,体质量为190 ～ 210 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号:SYXK(京)2020-0036。将大鼠适应性喂养1周,自由摄食和饮水,保持室温(23±1) ℃,相对湿度60%～70%,光照周期昼夜各12 h(7：00～19：00光照;19：00至次日7：00黑暗),室内安静。本研究由北京中医药大学实验动物伦理委员会审核通过,涉及实验动物的研究内容和过程均符合国家对医学实验动物的有关要求,伦理编号:BUCM-4-2021091308-3166。

1.2 药物与试剂刺五加、栀子、五味子、郁金(配方颗粒剂,北京康仁堂药业有限公司,批号:20033601、20036651、20034601、20016081);盐酸氟西汀胶囊(规格:每粒20 mg,礼来苏州制药有限公司,国药准字:J20170022)。全蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、预染蛋白分子量、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液、Western Blot检测试剂盒、显影定影试剂(江苏凯基生物有限公司,批号:KGP250、KGA902、KGP113、KGP441、KGP101、KGP103X、KGP1201、KGP116);大鼠IL-1β ELISA试剂盒(美国Proteintech公司,批号:KE20005);大鼠IFN-γ ELISA试剂盒(美国Raybiotech公司,批号:ELR-IFNg-1)。

1.3 仪器高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司,型号:Sorvall ST16R);荧光定量PCR循环仪(美国ABI公司,型号:Step one plus Real time-PCR system);微型电泳仪(美国Bio-Rad公司,型号:Power Supplies Basic);紫外分光光度计(日本SHIMADZU公司,型号:UV-2450);Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统(美国Bio-rad公司,型号:170-4150);凝胶成像系统(美国Bio-rad公司,型号:ChemiDoc MP Imaging System);台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司,型号:THZ-312);脱色摇床(江苏金坛市正基仪器厂,型号:HY-4);多功能酶标仪(美国MD公司,型号:Spectramac M3);超净工作台(中国苏州净化公司,型号:SW-CJ-1FD);敞箱(自制,型号:80 cm×80 cm×40 cm)。

2 方法

2.1 动物分组与模型制备32只大鼠适应性喂养1周,按照随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、颐脑解郁方组及盐酸氟西汀组,每组8只。正常组不予干预,常规饲养,其余3组大鼠采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)法连续刺激21 d同时联合孤养建立抑郁模型[7],即CUMS刺激时随机选取7种应激方法,包括:禁食24 h、禁水24 h、潮湿垫料24 h、夹尾1 min、4 ℃冰水游泳5 min,束缚2 h、昼夜颠倒,每种方法各应用3次。具体安排如下:

2.2 给药方法造模结束次日于行为学测试后,正常组、模型组、颐脑解郁方组和盐酸氟西汀组大鼠开始进行干预。参考课题组前期方法和剂量对颐脑解郁方和盐酸氟西汀组大鼠进行灌胃[8],颐脑解郁方组大鼠每天给予6.2 g·kg-1颐脑解郁方溶液灌胃,盐酸氟西汀组大鼠每天给予2.3 g·kg-1盐酸氟西汀溶液灌胃,灌胃体积均为10 mL·kg-1,连续灌胃28 d,正常组与模型组灌胃给予等体积蒸馏水。

2.3 行为学测试

2.3.1 旷场实验(open field test,OFT)旷场实验采用自制黑色无盖方箱,其底面用白线划分为25个16 cm×16 cm方格。将大鼠置于箱子中央方格中,记录大鼠3 min内的活动情况。观察指标包括活动总路程、静止时间、运动时间、水平运动得分及垂直运动得分,其中以大鼠穿越方格数(至少3爪进入方格)为水平运动得分,每格得1分;以大鼠前两肢直立次数为垂直运动得分,每直立1次得1分。每只测定结束后清理尿便并使用酒精消毒擦拭箱子内部,避免气味残留。记录造模前、造模后和干预28 d后各组大鼠的旷场得分情况。

2.3.2 糖水偏好实验(sucrose preference test,SPT)实验前3 d进行适应性训练,即第1天放2瓶均装有1%的蔗糖水;第2天1瓶装有1%的蔗糖水和1瓶纯净水,训练结束后禁食禁水12 h,再进行糖水偏好实验。将1瓶100 mL的1%蔗糖水与1瓶100 mL纯净水置于鼠笼前,12 h后分别称量瓶和水的质量,记录糖水和纯净水消耗量,得出大鼠糖水偏好率。造模前、造模后和干预28 d后各进行1次,分别计算大鼠糖水偏好率。

糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯净水消耗量)×100%

根据旷场实验结果和糖水偏好率筛选符合抑郁症模型者进入下一步实验测试,每组保证6只。

2.4 ELISA法检测各组大鼠血清炎症因子水平大鼠麻醉后,经腹主动脉取血,室温下静置30 min,3 000 r·min-1离心10 min(离心半径8 cm),取上清待测。参照ELISA试剂盒操作说明书,依步骤处理后通过酶标仪检测血清中IL-1β、IFN-γ的水平。

2.5 RT-PCR检测各组大鼠海马及前额叶皮质中NLRP3mRNA的水平按照Trizol试剂盒说明书提取脑组织总RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度;取2 μg RNA行反转录合成cDNA;参考试剂盒行RT-PCR,PCR反应体系为20 μL,反应条件为:95 ℃ 变性15 s、60 ℃退火 20 s、72 ℃ 延伸40 s,共 40个循环。以GAPDH作为内参,用2-ΔΔCt法计算NLRP3基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 大鼠21 d CUMS法安排表

2.6 Western Blot检测各组大鼠海马及前额叶皮质中NLRP3、GSDMD蛋白表达水平取出冻存的海马及前额叶皮质组织,分别加入组织裂解液,4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min后取上清液,BCA法检测总蛋白浓度,沸水浴10 min使蛋白变性后分别取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,NC膜置于5%脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h,滴加NLRP3(稀释比例为1：1 000)、GSDMD(稀释比例为1：2 000)、GAPDH(稀释比例为 1：5 000)抗体后4 ℃孵育过夜,洗膜后滴加二抗(稀释比例为1：5 000)室温孵育2 h,洗膜后滴加ECL显色,以目标蛋白(NLRP3、GSDMD)条带灰度值与内参(GAPDH)条带灰度值的比值计算目标蛋白相对表达量。

3 结果

3.1 各组大鼠糖水偏好率变化比较造模前,各组大鼠糖水偏好率差异无统计学意义(P>0.05)。造模后,与正常组比较,其余组大鼠糖水偏好率显著降低(P<0.05)。干预后,与正常组比较,模型组大鼠糖水偏好率显著降低(P<0.01);与模型组比较,颐脑解郁方组和盐酸氟西汀组大鼠糖水偏好率均显著增加(P<0.01)。见表3。

表3 颐脑解郁方对大鼠糖水偏好率的影响

3.2 各组大鼠旷场实验结果比较造模前,各组大鼠旷场实验结果差异无统计学意义(P>0.05)。造模结束后,与正常组比较,其余组大鼠活动总路程显著降低(P<0.05),运动时间显著减少(P<0.05),静止时间显著延长(P<0.05),水平运动得分和垂直运动得分显著降低(P<0.05)。干预后,与正常组比较,模型组大鼠活动总路程显著降低(P<0.05),水平运动得分和垂直运动得分显著降低(P<0.05);与模型组比较,颐脑解郁方组大鼠活动总路程显著延长(P<0.01),运动时间显著延长(P<0.05),静止时间显著减少(P<0.05),水平运动得分和垂直运动得分显著升高(P<0.05);盐酸氟西汀组大鼠活动总路程显著延长(P<0.01),水平运动得分和垂直运动得分显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 颐脑解郁方对大鼠旷场实验运动得分的影响

3.3 各组大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平比较与正常组比较,模型组大鼠血清中IL-1β、IFN-γ含量显著升高(P<0.05);与模型组比较,颐脑解郁方组与盐酸氟西汀组大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平显著下降(P<0.05)。见表5。

表5 颐脑解郁方对大鼠血清炎症因子的影响

3.4 各组大鼠海马组织NLRP3mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白表达水平的比较与正常组比较,模型组大鼠海马组织中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白以及GSDMD蛋白表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,颐脑解郁方组与盐酸氟西汀组大鼠海马组织中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白以及GSDMD蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。见表6、图1。

图1 海马中NLRP3、GSDMD蛋白表达条带

表6 颐脑解郁方对大鼠海马组织中NLRP3 mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白表达水平的影响

3.5 各组大鼠前额叶皮质组织中NLRP3mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白的比较与正常组比较,模型组大鼠前额叶皮质组织中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白和GSDMD蛋白表达量显著升高(P<0.05);与模型组比较,颐脑解郁方组与盐酸氟西汀组大鼠前额叶皮质组织中NLRP3mRNA和NLRP3、GSDMD蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。见表7、图2。

图2 前额叶皮质中NLRP3、GSDMD蛋白表达条带

表7 颐脑解郁方对大鼠前额叶皮质NLRP3 mRNA和NLRP3、GSDMD蛋白表达水平的影响

4 讨论

抑郁症在中医古籍中无相应记载,根据其临床表现特征,将其归属于中医郁病、不寐、癫证、百合病、梅核气等范畴[9]。课题组前期大样本临床研究发现,肾虚肝郁证是抑郁症中最常见的证候类型[10],在此基础上唐启盛教授提出益肾调气法治疗抑郁症并总结出经验方——颐脑解郁方,该方由刺五加20 g,栀子10 g,五味子10 g,郁金10 g组成。唐启盛教授认为本病起于所愿不遂,致肝郁气滞,肝失疏泄则胸胁胀满、喜叹息;病久及肾,耗损肾精肾气,因肾主骨生髓,肾精肾气耗损,则髓减脑消,脑之元神失养,则出现情绪低落、思维迟缓、失眠、健忘等[11-12]。颐脑解郁方中重用刺五加以补肾安神;郁金疏肝解郁、行气活血;五味子性温味酸甘,可收敛固涩、补肾宁心;少佐栀子疏肝清郁热以除烦[13]。现代药理学研究发现,颐脑解郁方的组成药物中含有多种有效活性成分,可通过抗炎、神经保护机制产生抗抑郁作用[14-17]。

本研究采用CUMS抑郁模型模拟人类因长期、慢性压力导致的抑郁状态,其病理生理机制与人类抑郁症的发病机制相似[18]。OFT和SPT是抑郁模型常用的行为学检测方法,OFT用于评价抑郁动物的自主活动和探索行为,抑郁动物的自主活动和探索行为减少;SPT用于评价动物的奖赏行为,糖水偏好降低是动物快感缺失的表现——抑郁症的核心症状之一[19]。实验结果显示,21 d CUMS应激结束后,和正常组相比,旷场实验显示其他三组大鼠活动总路程、运动时间减少,静止时间增加,水平运动得分、垂直运动得分降低,糖水偏好率偏低,提示模型制备成功。药物干预28 d后,与模型组相比,颐脑解郁方组和盐酸氟西汀组大鼠活动总路程增加,水平运动及垂直运动得分均上升,糖水偏好率上升,说明颐脑解郁方同盐酸氟西汀一样,可改善抑郁大鼠行为,提示颐脑解郁方具有抗抑郁作用。

细胞因子是一类多肽类物质,具有广泛的生物学功能,尤其是IL-1β和IFN-γ等重要的促炎细胞因子,可通过调节HPA轴、干扰5-羟色胺(5-hydroxytryptamin,5-HT)的代谢通路、破坏血脑屏障的完整性等多种机制[20],影响神经元的结构和功能,参与抑郁的发生。本研究发现,模型组大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平高于正常组,提示抑郁症的发生与促炎细胞因子关系密切。盐酸氟西汀为治疗抑郁症的一线药物,可抑制5-HT再摄取,有研究认为其还可减少IL-1β、IFN-γ等促炎细胞因子的分泌和释放[21]。本实验结果显示,颐脑解郁方组和盐酸氟西汀组大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平均下降,说明颐脑解郁方对CUMS大鼠血清中促炎细胞因子的分泌、释放起到抑制作用。

NLRP3炎性小体是调节促炎细胞因子的重要分子,它的激活也是导致抑郁症的重要发病机制。NLRP3炎性小体由NLRP3、ASC和Caspase-1三部分组成,其组装成功后促进GSDMD和 IL-1β成熟,其中GSDMD是细胞焦亡的执行蛋白,GSDMD成熟后使细胞穿孔,释放细胞质内的IL-1β,促进IFN-γ等炎症因子产生,从而引发炎症级联反应,促进抑郁的发生[22]。海马和前额叶皮质是边缘系统的重要组成部分,参与情绪的调节,是抑郁症常累及的部位[23]。研究发现,抑郁小鼠海马中NLRP3、GSDMD和IL-1β表达水平明显升高,而NLRP3基因敲除的小鼠未出现抑郁样表现,GSDMD、IL-1β蛋白表达水平没有升高[4]。本研究结果显示,抑郁大鼠海马和前额叶皮质组织中NLRP3mRNA及NLRP3和GSDMD蛋白表达水平升高,与其他研究结果一致。吕霞等[24]的研究发现,氟西汀可抑制CUMS大鼠脑内NLRP3炎性小体激活,提示颐脑解郁方组和盐酸氟西汀组可逆转CUMS应激导致的海马和前额叶皮质组织中NLRP3mRNA及NLRP3和GSDMD蛋白表达的上调,表明颐脑解郁方可抑制NLRP3的激活,减少GSDMD的表达,进而减少促炎细胞因子IL-1β和IFN-γ的成熟和释放,从而改善CUMS大鼠的抑郁样行为。

综上所述,颐脑解郁方可有效改善CUMS大鼠的抑郁样行为,可能与抑制海马和前额叶皮质组织中NLRP3的激活从而发挥抗细胞焦亡和抗炎作用有关。但是颐脑解郁方为中药复方,具有多成分、多靶点和多通路的特性,本实验仅初步探索其对NLRP3相关炎症蛋白的影响,具体通路和机制仍有待进一步阐明。