贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的网络药理学机制分析

边 云, 白海龙, 孟晓峰, 刘 晓, 薛 超, 刘瑞雪,常洪坤, 田风胜, 崔荣岗, 苏 阳, 刘 梅

(河北省沧州中西医结合医院, 1. 糖尿病三科, 2. 治未病中心, 3. 超声二科, 4. 眼科, 河北 沧州, 061001)

糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的微血管并发症[1]。一项全球荟萃分析[2]报告,近1/3的糖尿病患者被诊断出患有糖尿病视网膜病变, 1/10的糖尿病视网膜病变患者会发展为影响视力的疾病。预防和治疗糖尿病视网膜病变主要通过规范使用肠激肽酶、羟苯磺酸钙等药物,尽管部分患者视力有所改善,但仍有46%的患者需要激光和(或)手术治疗[3]。中医药治疗糖尿病视网膜病变历史悠久,积累了丰富的实践经验,具有多成分、多靶点、多途径的优势。现代药理学研究[4]发现,中药可以改善眼底局部的血液循环,促进眼底渗出物的吸收,减少血管瘤的数量,从而起到治疗作用。贞莲明目胶囊[4]由女贞子、墨旱莲、黄精、决明子、枸杞子、地黄、三七、丹参、白茅根、白术、泽泻、车前子组成,具有滋补肝肾、凉血止血、活血利水的功效,主治肝肾亏虚夹瘀证,目前临床上主要用于治疗糖尿病或多种眼部疾病。贞莲明目胶囊可提高糖尿病视网膜病变患者的视力水平,并改善其视网膜血管病变[5]。目前对贞莲明目胶囊有效成分、作用靶点等药理机制的研究较少。网络药理学以网络的形式表达药物成分与其作用靶点之间的关系,通过对网络节点的分析,获得中药复方的主要活性成分和作用靶点,构建药物-靶点-疾病的网络关系,可为活性化合物筛选和其机制探索提供新方法。

1 资料与方法

1.1 网络药理学及分子对接探讨贞莲名目胶囊的作用机制

1.1.1 主要成分检索、筛选和作用靶点确定: 通过SymMap(http://symmap.org//)和中国天然产物化学成分库(http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc/), 分别以贞莲明目胶囊中女贞子、墨旱莲、黄精、决明子、枸杞子、地黄、三七、丹参、白茅根、白术、泽泻、车前子为关键词检索各味中药的化学成分。以口服利用度≥30%且类药性≥10%作为筛选条件,对检索到的化学成分进行筛选。使用TCMSP数据库和已发表文献对筛选出的化学成分对应的靶点进行查询,并将靶点与Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)进行匹配和规范。

1.1.2 糖尿病视网膜病变相关靶点搜集、筛选和匹配: 通过GeneCards(https://www.genecards.org/), 以糖尿病视网膜病变为关键词检索相关基因,筛选与糖尿病视网膜病变相关性高的基因靶点。

1.1.3 药物-有效成分-靶点网络绘制: 应用R4.0.3软件对贞莲明目胶囊和糖尿病视网膜病变的相同靶点进行整合,并结合上述关键靶点,依托Cytoscape3.7.0软件构建中药-靶点-疾病的网络信息图。

1.1.4 京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路和基因本体(GO)功能分析: 利用R4.0.3软件对所有的关键靶点进行KEGG和GO分析,根据P值筛选出前10位的生物过程、细胞组分、分子功能的数据,绘制柱形图、气泡图和信号通路图。

1.1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及核心靶点筛选: 利用STING(http://sting-db.org/)数据平台建立PPI网络图,将贞莲明目胶囊和糖尿病视网膜病变共有的关键靶点导入,设置最高互作分值为0.9, 去除隐藏的游离节点后共得到153个关键靶点,构建PPI图。

1.1.6 药物主要活性成分-核心靶点分子对接验证: 在RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)数据库检索和下载潜在靶蛋白的PDB ID, 活性化合物的结构在中药系统药理学数据库和分析平台数据库中以*mol2格式下载。通过AutoDock软件将化合物配体和蛋白质转化为"PDBQT"格式,应用SYBYL-X2.0软件进行模拟分子对接,绘制模拟对接图像,并计算有效成分与靶蛋白对接的结合能,结合能越低可以认为结合效果越好。

1.2 实验验证

1.2.1 药物: 贞莲明目胶囊由女贞子、墨旱莲、黄精、决明子、枸杞子、地黄、三七、丹参、白茅根、白术、泽泻、车前子组成,链脲佐菌素(南京沃博生物科技有限公司,货号M5721), 羟苯磺酸钙片组 (南京长澳制药有限公司,国药准字H20030087)。

1.2.2 动物: 选取60只SPF级Wistar大鼠, 月龄3个月,体质量为(200±20) g, 由动物中心提供。造模后72 h进行检测,血糖均不低于16.7 mmol/L, 荧光素血管造影检查发现眼底新血管形成和微血管荧光素渗出即为造模成功。

1.2.3 动物分组、模型制备、给药与取样: 将所购SPF级Wistar大鼠,按照随机数字表法分为正常组、模型组、羟苯磺酸钙片组、贞莲明目胶囊组,每组15只,于实验室内适应性饲养1周,未见不良反应。参照糖尿病视网膜病动物模型制备规范[6]制备糖尿病视网膜病大鼠模型,除正常组大鼠,其余大鼠均予高糖高脂饮食喂养4周后,腹腔注射链脲佐菌素溶液(42 mg/kg), 注射72 h后抽取尾间血进行检测,血糖均不低于16.7 mmol/L, 荧光素血管造影检查发现眼底新血管形成和微血管荧光素渗出提示造模成功。造模结束后,正常组和模型组大鼠予0.9%氯化钠注射液,每次2.0 mL, 每日1次灌胃。羟苯磺酸钙片组予羟苯磺酸钙片溶液,参照人和大鼠换算比例制备成0.83 mg/mL溶液,每次2.0 mL, 每日1次灌胃。贞莲明目胶囊组予贞莲明目胶囊溶液,浓度0.83 mg/mL, 每次2.0 mL, 每日1次灌胃。所有大鼠均连续灌胃治疗4周。最后1次给药结束后,予3%浓度的戊巴比妥钠,按照40 mg/kg剂量对大鼠进行麻醉,采用光学相干断层扫描(OCT)测量视网膜厚度,快速切取各组大鼠视网膜, 4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋切片。同时腹主动脉取血,快速离心后-80 ℃保存。

1.3 观察指标

大鼠视网膜厚度、视网膜炎症指标情况: 记录大鼠视网膜厚度和白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。采用蛋白质印迹法检测视网膜中蛋白[血管内皮生长因子(VEGF)、核转录因子-κB(NF-κB)]表达: 取子宫内膜组织约10 mg, 加入组织裂解液后匀浆, 12 000转/min离心10 min, 分离上清后进行蛋白质印迹实验,在聚丙烯酰胺凝胶中分离出不同分子量的蛋白,电转移至硝酸纤维素膜后,用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后,添加一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜,次日添加二抗1 h后,定量分析蛋白表达水平。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 贞莲明目胶囊活性成分及其靶点

通过SymMap 数据库初步提取2 367种化学成分,经过口服利用度和类药性筛选后获得三七119种,丹参202种,决明子68种,地黄76种,墨旱莲48种,女贞子119种,枸杞子188种,泽泻46种,白术55种,白茅根33种,车前子55种,黄精38种。再将上述化学成分输入TCMSP数据库,搜索与之相对应的成分作用靶点,合并以后删除重复值,共得到有效成分作用靶点248个。贞莲明目胶囊药物-有效成分-靶点网络内重要性前10位的有效成分见图1、表1。

表1 贞莲明目胶囊重要性前10位有效成分

2.2 贞莲明目胶囊治疗的核心靶点及蛋白质相互作用关系

通过Drugbank和Uniprot等数据库检索,共收集到3 943个糖尿病视网膜病变相关靶点。将贞莲明目胶囊有效成分靶点和糖尿病视网膜病变相关基因进行匹配后,得到153个贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的潜在靶点基因,见图2。

图2 贞莲明目胶囊靶基因与糖尿病视网膜病变相关基因的维恩图

2.3 贞莲明目胶囊有效成分治疗糖尿病视网膜病变核心靶点的KEGG信号通路

KEGG富集分析显示,胰岛素信号通路、MAPK信号通路、黏着斑、神经营养因子信号通路、细胞衰老、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、细胞周期、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、细胞凋亡、内分泌抵抗与153个核心靶点密切相关,见图3。

图3 贞莲明目胶囊有效成分治疗糖尿病视网膜病变核心靶点的KEGG分析气泡图

2.4 贞莲明目胶囊有效成分治疗糖尿病视网膜病变核心靶点的GO功能分析

GO功能富集分析包括生物过程、细胞组分、分子功能共3个部分,生物过程分析显示,蛋白质修饰过程的调控、细胞蛋白质代谢过程的调节、蛋白质代谢过程的调节、分子功能的调节、催化活性的调节、细胞内信号转导、蛋白质修饰过程的正向调控、蛋白质代谢过程的正向调控、细胞蛋白质代谢过程的正向调控、程序性细胞死亡的调节在贞莲明目胶囊对糖尿病视网膜病变的治疗过程中具有重要作用; 细胞组分分析显示,胞质溶胶、核质、细胞器腔、膜封闭内腔、核腔、核部分、蛋白质复合物、高分子复合物、膜筏、核染色体在贞莲明目胶囊对糖尿病视网膜病变的治疗过程中具有重要作用; 分子功能分析显示,酶结合、激酶结合、蛋白激酶结合、转录的正调控(依赖于 DNA)、蛋白质复合物结合、ATP结合、腺苷酸核苷酸结合、腺苷酸结合、嘌呤核糖核苷酸结合、嘌呤核苷酸结合酶结合在贞莲明目胶囊对糖尿病视网膜病变的治疗过程中具有重要作用,见图4。

图4 贞莲明目胶囊有效成分治疗糖尿病视网膜病变核心靶点的GO功能分析

2.5 PPI网络构建及核心靶点的筛选

使用Cytoscape对PPI网络进行拓扑分析,得到包含10个节点的核心网络,其中白细胞介素-1β(IL1β)、白细胞介素-6(IL6)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、人表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、RACα丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤蛋白P53(TP53)、胱天蛋白酶3(CASP3)、环状素受体1(ESR1)和环加氧酶2(PTGS2)基因是核心靶点,见图5。

图5 贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变靶点的核心PPI网络

2.6 分子对接验证

由以上分析结果选取贞莲明目胶囊中药化合物为槲皮素、油酸、木犀草素、山奈酚和丹参酮ⅡA以及靶点IL-1β、AKT1、TP53、CASP3、EGF进行分子对接,对接总分表明成分靶点结合的稳定性较好,碰撞参数均小于0, 表明小分子配体与蛋白结合的构象稳定,见表2、图6。

A: 靶蛋白IL-1β的分子结构,绿色部分为IL-1β的三维结构活性口袋; B: 五羟黄酮与IL-1β活性口袋的模拟对接图像,其中未被绿色覆盖部分为五羟黄酮分子结构,黄色虚线为五羟黄酮与IL-1β模拟对接的作用点。图6 贞莲明目胶囊主要成分与核心靶点的典型分子对接图

表2 核心靶点与贞莲明目胶囊主要成分模拟对接参数

表3 各组大鼠视网膜厚度、视网膜炎症指标情况

2.7 大鼠视网膜厚度、视网膜炎症指标情况

与正常组比较,模型组大鼠视网膜厚度降低, IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,羟苯磺酸钙片组大鼠视网膜厚度升高, IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与羟苯磺酸钙片组比较,贞莲明目胶囊组大鼠视网膜厚度升高, IL-1β、IL-6、TNF-α降低,差异有统计学意义(P<0.05), 见表3。

2.8 大鼠视网膜中蛋白表达

与正常组比较,模型组大鼠VEGF、NF-κB表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,羟苯磺酸钙片组大鼠VEGF、NF-κB表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与羟苯磺酸钙片组比较,贞莲明目胶囊组大鼠VEGF、NF-κB表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05), 见表4。

表4 各组大鼠视网膜中VEGF、NF-κB蛋白表达

3 讨 论

糖尿病视网膜病变是糖尿病患者的主要并发症,会导致视力丧失[7-8]。在全球范围内,有9 500万例糖尿病患者患有糖尿病视网膜病变,而糖尿病患者数量的增加将导致未来糖尿病视网膜病变患者数量的增加[9]。相关研究[10]发现,患糖尿病20年后,几乎所有1型糖尿病患者和60%的2型糖尿病患者都发展为糖尿病视网膜病变,已然成为了全球的公共健康问题。调查[11]显示,经常规西医治疗后,仅有部分患者的视力有所改善,仍有46%的患者需要激光或手术治疗。为了实现和控制糖尿病患者视网膜内的血管病变,通常需要多种治疗途径,故本研究结合糖尿病视网膜病变的病因特点,预测贞莲明目胶囊可能对糖尿病视网膜病变起到一定的治疗作用,并基于网络药理学,将贞莲明目胶囊的有效成分和疾病的靶点进行对接,建立药物-靶点-疾病的网络关系,最后应用分子对接确定结果的有效程度。

通过对贞莲明目胶囊的有效化学成分与糖尿病视网膜病变关键靶点的网络药理学研究发现,贞莲明目胶囊中153种活性成分作用于糖尿病视网膜病变的关键靶点,其中主要成分为丹参酮、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等, QIAN S H等[12]发现丹参酮可通过提高GLO1水平来改善晚期糖基化终产物诱导的线粒体功能障碍和有丝分裂,可抑制高糖诱导的人视网膜内皮细胞增殖、迁移和血管化。CHAI G R等[13]发现槲皮素可通过诱导HO-1的表达抑制VEGF和sICAM-1的分泌,以达到治疗糖尿病视网膜病变的目的。SAFARPOUR S等[14]发现山柰酚可激活肝脏内Akt和GCK活性,通过增强肝脏葡萄糖摄取和代谢来改善葡萄糖稳态,另外还可通过ERK和VASH1信号通路保护视网膜神经节细胞免受高糖损伤,有助于治疗糖尿病视网膜病变。AFIFI S M等[15]发现, β-谷甾醇通过激活糖尿病大鼠脂肪组织中的胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白来控制胰岛素抵抗和高血糖,同时还通过调节脂肪组织中的炎症事件来减轻视网膜损伤。从上述研究中可以看出丹参酮、槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇等成分具有抑制糖尿病视网膜病变的作用。

PPI网络图分析表明,贞莲明目胶囊的有效成分主要作用于IL-1β、IL-6、STAT3、EGFR、EGF、AKT1、TP53、CASP3、ESR1和PTGS2多个核心靶点,其中IL-1β、EGF/EGFR/P13K/AKT、IL6/STAT3通路介导的炎症反应可能是贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的关键靶点。相关研究[16]发现,高血糖会引起线粒体活性氧增加,在活性氧诱导下的白细胞介素刺激细胞黏附分子的表达上调,导致内皮细胞损伤和视网膜内血管病变。另一项研究[17]发现, IL-1β可通过激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路使IL-6的表达上调,进一步激活STAT3信号通路,降低紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达,从而降低了视网膜血管内皮的通透性,导致视网膜病变。张金峰等[18]发现,丹参酮可通过抑制IL-1β、IL-6等细胞因子的释放和AKT、NF-κB等蛋白的表达,从而减轻了炎症反应对视网膜的损伤。HAN X J等[19]发现槲皮素是细胞中NLRP3炎性体激活的天然抑制剂,可通过抑制NLRP3/IL-1β途径,减轻促炎因子释放,起到保护视网膜的作用。另外,相关实验研究[20-21]发现,山柰酚、β-谷甾醇均可抑制IL-1β、IL6等细胞因子表达,使VEGF水平降低,从而改善视网膜内皮血管的形成和细胞增殖。由上述研究可知, IL-1β、EGF/EGFR/P13K/AKT、IL6/STAT3信号通路可能是贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的关键靶点。

此外, KEGG通路分析发现, TP53信号通路和CASP3信号通路可能是贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的相关靶点。相关研究[22]发现, TP53信号通路在调节细胞周期方面具有核心作用,其中TP53为关键基因,可干扰Bcl-2等促凋亡因子和Bcl-xl等抗凋亡因子的结合,使线粒体内的凋亡相关蛋白释放,导致视网膜内细胞凋亡。实验研究[23]发现, TP53还整合了影响胰岛素敏感性和肝脏对葡萄糖稳态方面的反调节激素反应的信号通路,对于调节血糖的稳态具有关键作用。研究[24]发现, TP53诱导caspase-3活化,激活CASP3触发凋亡的级联反应,加速细胞凋亡。米倚林等[25]发现,山奈酚可调节组织内TP53和CASP3蛋白的表达,抑制细胞的凋亡,从而延缓糖尿病视网膜病变的进程。LIU R等[26]发现, β-谷甾醇可调节CASP3基因的表达,抑制视网膜内细胞的凋亡,从而缓解患者症状。由上述研究可知, TP53信号通路和CASP3信号通路可能是贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的相关靶点。

本研究发现, ESR1、PTGS2可能是贞莲明目胶囊治疗糖尿病的潜在靶点。一项回顾性研究[27]发现, ESR1作为转录因子,可以调节SLC2A4基因的表达,改变组织GLUT4含量,以控制血糖水平,避免了高血糖对视网膜的损害。另一项研究[28]发现, PTGS2作为一种重要的免疫调节因子,可通过调节NF-κB通路,从而减轻视网膜损害。研究[29-31]发现,丹参酮、槲皮素、β-谷甾醇均可作用于ESR1或PTGS2靶点,以维持血糖稳定,从而避免了高血糖对视网膜的损伤。由上述研究可知, ESR1、PTGS2可能是贞莲明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的潜在靶点。

综上所述,贞莲明目胶囊具有滋补肝肾、凉血活血的功效,其对糖尿病视网膜病变的治疗或许具有积极作用,其作用机制可能与调节IL-1β、EGF/EGFR/P13K/AKT、IL-6/STAT3、TP53和CASP3信号通路有关。