SREBP2及PI3K/Akt/mTORC2在喉癌中的表达及相关性研究*

陈 薇,杨 勇

(江西省人民医院/南昌医学院第一附属医院甲状腺头颈外科,江西 南昌 330006)

喉癌是一种来源于喉部黏膜上皮的恶性肿瘤,其中96%～98%为鳞状细胞癌,2020年全球喉部鳞癌发病率占头颈部鳞癌的21%,位居第二,男性发病率高于女性,男性喉癌发病率为3.6/10万,死亡率为1.9/10万,女性喉癌发病率为0.5/10万,死亡率为0.3/10万[1]。喉癌临床表现多见为声音嘶哑、咽喉异物感、咳嗽、吞咽困难、颈部质硬包块、呼吸困难等,其发生主要与吸烟喝酒、病毒感染、环境及遗传因素相关[2]。目前喉癌治疗方案为以手术治疗为主,以放疗、化疗及免疫治疗为辅的综合治疗[3]。早期喉癌症状不明显,明确诊断时多为中晚期,尽管喉癌的治疗方式日趋完善,但晚期喉癌患者在治疗后多因局部复发和远处转移而导致预后较差。进一步研究喉癌的病因和分子机制,寻找和开发有效的治疗靶点,将会对喉癌的早期诊断、治疗及改善预后产生重要作用。近年来,针对肿瘤细胞的异常代谢过程,靶向代谢重编程已成为潜在的肿瘤治疗方案之一。胆固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)是近年来在多种研究中异常表达的调控脂质代谢的关键转录因子,基础研究发现靶向SREBP2具有一定的抗肿瘤效果,可作为靶向代谢重编程的靶点[4]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C2(mTORC2)信号通路参与了众多癌症细胞自噬、凋亡、组织转移过程,其异常激活会影响多种肿瘤细胞增殖和转移的演进过程[5]。PI3K/AKT/mTORC2信号通路是调控SREBP2表达的关键通路,在卵巢癌中可促进胆固醇的合成及肿瘤生长[6]。然而PI3K/AKT/mTORC2信号通路及SREBP2分子在喉癌中的表达及作用机制尚不清楚。本研究聚焦PI3K/AKT/mTORC2及SREBP2在喉癌组织中的表达水平,为开发以SREBP2为靶点的喉癌靶向代谢重编程疗法提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2019年1月至2022年6月病理确诊为原发性喉癌的患者60例,其中男55例,女5例,年龄47～87岁,平均(67.93±8.83)岁。所有研究病例均已知晓本次研究内容及目的,且自愿签署知情同意书。本研究已获得医院医学伦理委员会批准。排除标准:(1)曾接受放疗、化疗及免疫治疗者;(2)合并其他器官、造血系统严重疾病者;(3)合并精神或神经性疾病患者。

1.2方法

1.2.1样本采集 收集患者的肿瘤组织(喉鳞状细胞肿瘤组织)及癌旁组织(声带息肉)样本,使用多聚甲醛固定10～12 h后脱水、石蜡包埋、组织切片,用于免疫组织化学(免疫组化)检测。

1.2.2主要试剂 兔抗人SREBP2单克隆抗体购自江苏亲科生物研究中心有限公司,兔抗人PI3K单克隆抗体购自福建迈新生物技术公司,鼠抗人AKT单克隆抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司,鼠抗人mTORC2单克隆抗体购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2.3免疫组化(Envsion二步法) 将组织置于67 ℃烤箱中烘烤30 min,二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。使用高压热修复行抗原修复,冷却后蒸馏水冲洗 2次,后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,每次3 min。以含1% 牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐平衡生理盐水缓冲液(PBS)进行封闭处理,作用30 min。3%过氧化氢去离子水室温下孵育10 min,PBS冲洗3次,每次3 min。滴加一抗(预试验选定PI3K抗体为即用型,AKT抗体的工作浓度为1∶200,mTORC2抗体的工作浓度为1∶200,SREBP2抗体的工作浓度为1∶200),室温下孵育2 h。PBS冲洗3次,每次5 min。滴加新鲜配制的DAB显色,显微镜下观察以适度为止。苏木精复染,自来水冲洗,梯度乙醇脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。上述步骤中由试剂公司提供照片作为阳性对照,用 PBS代替一抗作为阴性对照,以排除非特异性着色。

1.2.4免疫组化结果判定标准 按切片中细胞染色强度评分:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;每张切片在400×显微镜下任意选取5格不重叠视野进行阳性细胞计数,每个视野计数200个细胞,计算5个视野中的阳性细胞色平均百分比,按照百分比计分:0为0分,>0～25%为1分,>25%～50%为2分,>50%～75%为3分,>75%～100%为4分。以上两项得分相加(0～7分),<3分为(-),3分为(+),>3～5分为(++),>5～7分为(+++)。分别计数各项得分的例数。

2 结 果

2.1不同倍数显微镜观察下各分子在喉癌组织中表达情况 在高倍显微镜(400×)观察下,相较于癌旁组织,PI3K、AKT、mTORC2在喉癌组织中高表达,并主要定位于细胞核和细胞质中;SREBP2在喉癌组织中高表达,并主要定位于细胞核中,见图1。PI3K、AKT、mTORC2与SREBP2在低倍显微镜(200×)观察下表达情况见图2。

2.2各分子在不同组织中阳性表达情况 各分子在肿瘤组织中表达阳性率显著高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3不同临床特征患者各分子阳性表达情况比较 不同性别、年龄、吸烟(包/年)、肿瘤部位患者PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2表达情况比较,差异均无统计学意义(P>0.05);肿瘤直径大于或等于3 cm患者AKT、mTORC2、SERBP2阳性表达率均高于肿瘤直径小于3 cm患者,差异均有统计学意义(P<0.05);临床分期Ⅲ～Ⅳ期患者AKT、SERBP2阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患者,差异均有统计学意义(P<0.05);不同分化程度患者PI3K、AKT阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),不同分化程度患者mTORC2、SERBP2阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床特征患者各分子阳性表达情况比较[n(%)]

2.4各分子不同表达患者预后情况比较 PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2阳性表达患者2年生存率均低于阴性表达患者,但是两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各分子不同表达患者预后情况比较

3 讨 论

喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤。有研究认为,吸烟是喉癌发生的首要致病因素,长期大量的吸烟、喝酒会干扰细胞抑癌基因的代谢,促进细胞的异常增殖,导致喉癌的发生[7]。目前,与喉癌相关的分子机制主要有:(1)信号调控异常,如NER、BER、DSBR通路及MMR信号通路传导异常;(2)基因突变,如MYCT、POM121突变及编码多种microRNA的基因突变;(3)抑癌基因的异常甲基化;(4)线粒体基因改变;(5)线粒体呼吸功能障碍等。

喉癌细胞生长、增殖、侵袭和转移与能量代谢和遗传相关。肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移需要大量能量,故肿瘤细胞的演进过程常与脂质代谢异常相伴而行[8]。SREBP是脂类代谢合成和致癌信号通路中关键的转录因子[9],有3种亚型:SREBP1a、SREBP1c和SREBP2,其中SREBP2在各脏器中均广泛表达,主要调控胆固醇合成代谢[10],转运至高尔基体产生SREBP2m,可进入细胞核后,调控MVA通路,参与脂质代谢及胆固醇合成[11]。多种细胞信号通路对SREBP2成熟具有调控作用,胰岛素可以通过PI3K/AKT/mTORC2信号通路激活SREBP2的表达,加速胆固醇从头合成。SREBP2与炎症、自噬和细胞凋亡的致病过程密切相关,加速多种代谢紊乱的发生、发展[12]。SREBP2在多种癌细胞中被激活,其下游参与脂代谢的靶基因表达升高,参与肿瘤细胞的发生、发展[4]。JIE等[13]研究发现,SREBP2通过促进破骨细胞生成和乳腺癌转移来加重乳腺癌相关的骨质溶解。GAO等[14]通过使用SREBP活化的特异性抑制剂fatostatin,证实阻断子宫内膜癌中SREBP调节的代谢途径可抑制肿瘤生长并增强细胞凋亡。李晓枫等[15]研究显示SREBP2在原发性肝癌中高表达,与病理类型、分化程度、门静脉侵袭及TNM分期等临床特征及预后有关,SREBP2高表达明显增加患者死亡风险。刘坤等[16]研究在肾癌细胞中,SREBP等许多脂质代谢的关键因子发生改变,通过脂类抑制剂能抑制肾癌细胞的生长;胆固醇代谢基因SREBP1和SREBP2的表达,可通过增加VEGF-C的表达诱导淋巴管生成,促进胃癌淋巴结转移。张莉等[17]证实了SREBP2通过改变结肠癌的细胞代谢来抑制结肠癌的生长,同时降低了与癌症干细胞相关基因的表达。YU等[18]研究发现lincRNA,SNHG16通过直接miR-195/SREBP 2轴调控脂肪生成,促进胰腺癌的发展。目前,在肝癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤中均已发现异常表达的SREBP2[13-16]。

近年来,针对肿瘤细胞的异常代谢过程,靶向代谢重编程已成为潜在的肿瘤治疗方案之一。PI3K/AKT/mTORC2信号通路是调节SREBP1和SREBP2表达的关键信号通路,通过mTORC2分子调控卵巢癌细胞中SREBP2表达,并影响胆固醇代谢及肿瘤生长[6]。目前,许多靶向PI3K信号通路抑制剂已进入临床试验,如BKM120(布帕利西布)是一种口服泛Ⅰ类可逆PI3K抑制剂,在耐受剂量下在人肿瘤异种移植模型中表现出良好的口服生物利用度和显著的抗肿瘤活性[17]。靶向SREBP2同样具有潜在的抗肿瘤作用。WEI等[19]证实可溶的青蒿素类似物青蒿琥酯可通过抑制SREBP2的核定位及其靶基因HMGCR的表达,限制MVA途径来加速胶质瘤细胞衰老,具有潜在的抗肿瘤作用。KIM等[20]证实大黄素联合索拉非尼可抑制肝癌细胞中SREBP2转录活性,从而抑制胆固醇生物合成和致癌AKT信号传导,是晚期肝癌患者潜在的疗法之一。有研究证实,SREBP1和SREBP2是PI3K信号通路调控的下游分子之一[21],而靶向SREBP2的基础研究也显示了较好的肿瘤抑制效果[22],表明靶向PI3K治疗肿瘤的可能机制之一是抑制SREBP2表达。本研究发现喉鳞状细胞癌患者肿瘤组织中PI3K/AKT/mTORC2通路分子及SREBP2高表达,而间质组织细胞阴性,相较于癌旁组织,喉癌组织PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2分子表达阳性率显著升高,蛋白质水平证实了PI3K/AKT/mTORC2信号通路及SREBP2分子在喉癌组织中的异常表达,是潜在的喉癌靶向代谢重编程治疗的靶点。

本文选取原发性喉癌患者60例,取肿瘤组织及癌旁组织样本,以免疫组化法测定PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2表达情况并进行比较。肿瘤组织PI3K(88.3%vs.40.0%)、AKT(76.7%vs.31.7%)、mTORC2(78.3%vs.21.7%)、SERBP2(65.0%vs.8.3%)阳性表达率高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。肿瘤直径大于或等于3 cm患者AKT、mTORC2、SERBP2阳性表达率高于肿瘤直径小于3 cm患者,差异均有统计学意义(P<0.05);临床分期Ⅲ～Ⅳ期患者AKT、SERBP2阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患者,差异均有统计学意义(P<0.05);不同分化程度患者mTORC2、SERBP2阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2阳性表达患者2年生存率低于阴性表达患者,但差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述,喉癌患者肿瘤组织中PI3K/AKT/mTORC2信号通路分子及SREBP2分子蛋白质水平存在异常表达,相较于声带息肉,喉癌组织PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2分子表达阳性率显著升高,是潜在的喉癌靶向代谢重编程治疗的靶点。