两个南方红豆杉天然居群的交配系统分析

罗芊芊,李峰卿,肖德卿,邓章文,王建华,周志春*

(1. 抚州市林业科学研究所,江西 抚州 344000;2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江 杭州 311400;3. 中国林业科学研究院亚热带林业实验中心,江西 分宜 336600)

南方红豆杉(Taxuswallichianavar.mairei)是集药用、材用和观赏于一体的珍稀濒危树种[1],主要分布于我国亚热带季风区的各省山区。在天然居群中,南方红豆杉个体呈小范围内聚集分布,偶有雌雄同株或自花授粉现象[2-3],且居群的年龄结构多以老龄为主,幼龄为辅,幼龄个体数量和生长速度难以支撑居群的扩展进程[3-5]。鉴于南方红豆杉的濒危现状,研究人员已对其群落生态学[6-7]、分子生物学[8-9]、种子发芽生理学[10-11]、生长过程和生长规律[12-13]、培育和栽培技术[14-15]等方面进行了深入研究。然而,对南方红豆杉的科学保护应结合其现存居群规模和遗传多样性水平进行。

植物交配系统是维持两代个体间遗传联系的有性系统,它决定着后代群体的基因型分布和种群动态(有效群体大小、性别比例和随机交配程度),与居群遗传动态密切相关,且有助于了解有效居群变小的遗传后果[16]。在为珍稀濒危树种遗传改良开展的数量遗传学研究中,绝大多数的遗传参数估算都必须以交配系统为基础[17],其遗传资源保护方案的制定也与交配系统密切相关[18-19]。南方红豆杉的雌、雄生殖系统发育不一致,晚期发育的胚珠很难正常授粉且生殖周期较长,这些生殖特性是导致其自然繁殖较困难的一个重要的内部因素。在严苛的环境条件筛选下,幼龄树生存艰难,易出现生长发育不良甚至大面积死亡的现象。天然居群更新过程中,因生境岛屿化,各居群间基因交流受阻,近交愈发频繁,降低了物种的遗传多样性,使其适应性和抗逆性减弱。此外,森林破碎化引起的林地环境条件改变,导致南方红豆杉的天然分布范围不断收缩。生境破坏、基因流受阻及其生殖特性致使南方红豆杉自然更新困难,这是其濒危的主要原因[20]。南方红豆杉天然小居群存在难以忽视的问题甚至是灭绝的风险。因此,本研究采用SSR标记研究南方红豆杉天然居群的交配系统,揭示该树种天然居群的交配机制以及亲代间遗传多样性的差异,为南方红豆杉天然居群的长期保护以及遗传资源的改良利用提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料来源、样本采集及处理

试验主要对南方红豆杉天然分布区内的2个居群进行研究,分别位于浙江省龙泉市和江西省分宜县。2个居群所处地理位置均属亚热带湿润季风气候,气候温和、雨量充沛[21]。2018年11月,在浙江龙泉和江西分宜居群中,采集亲本样本时,对于50株以下的天然古树或大树居群,则选取所有古树或大树(幼龄植株不选取),浙江龙泉居群的取样数是人力范围内所能采集到的最大样本数(22个),实际的植株数量略大于样本数(22～30个);对于50株以上的居群,则仅选取其中代表性的50株,要求这50株植株分布均匀,且植株间隔50 m以上,因此江西分宜居群的实际采样数量为50,最后可提取到DNA的样本为49个。采集子代样本时,分别就所有当年结实的亲代分单株进行采种,同一母株上的种子组成1个家系。取样及采种详细信息见图1和表1。采种居群内的结实母株数量较少,在浙江龙泉居群仅采集到5个母株的种子,江西分宜居群仅采集到3个母株的种子,共计8个母株(表1)。

表1 南方红豆杉天然居群取样母株基本信息

图中黄色星形图案表示采种母株,红色圆点表示居群内的亲代,序号表示株号。 The yellow star pattern represents the mother plant of seed collection, and the red dots represent the parental plant in the population, the serial number indicates the plant number.图1 南方红豆杉天然居群中亲代和采种母株的分布Fig. 1 Distribution of parental plants and mother plants in natural populations of Taxus wallichiana var. mairei

2019年12月将采集到的家系种子播种于浙江省龙泉市林业科学研究院保障性苗圃,2020年10月将家系幼苗运输至实验室,采集家系子代幼苗叶片,每家系子代采集叶片4～6片(子代个体数超出35个的,采集个体数为35个,不足35个子代的全部采集)。

1.2 总DNA提取及SSR-PCR扩增

采用DNA提取试剂盒提取亲代及子代样本的基因组DNA,利用NanoDrop-2000和1.0%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量及浓度。本试验选用12对条带清晰、多态性强的SSR引物进行PCR扩增(S7、S24、S34、S36、S41、S44、S45、S64、S77、S79、S82、S93)[22-23](表2)。PCR扩增反应在TaKaRa PCR Thermal Cycle Dire Touch上进行。PCR扩增反应体系为25 μL:2×TaqPlus Master Mix(Vazyme Code:P211-02)12.5 μL,引物F&R(10μmol/L)1 μL,DNA模板(20 ng/μL)2 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR扩增反应在Takara TP600R Thermal Cycler上进行,其程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,54～63 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,35个循环;72 ℃延伸7 min。采用Qsep100TM全自动核酸蛋白分析系统对所有PCR扩增产物进行电泳分离检测[21]。

表2 12对引物的基本信息

1.3 数据分析

1.3.1 遗传多样性

使用Q-analyze 3.0对SSR检测结果进行峰图分析及等位基因的读取,然后采用GenALEx 6.5[24]对居群内亲代的遗传多样性进行分析,遗传多样性参数包括等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon’s多样性指数(I)和固定指数(F=1-Ho/He)。采用HP-Rare 1.1[25]计算等位基因丰富度(AR)及私有等位基因丰富度(PA)。运用FSTAT 2.9.3[26]进行1 000次模拟,对上述遗传多样性参数在每个居群内亲代间的区别进行检测,并计算亲代的近交系数(Fis)[27]。

1.3.2 交配系统参数分析

本研究采用MLTR 3.4对南方红豆杉交配系统遗传参数进行估计[28]。采用最大期望值(expectation maximization,EM)法,在参数默认设置(t=0.9,FM=0.1,rt=0.1,rp=0.1)和95%的置信区间下经过1 000次重复取样(bootstraps),估算单位点异交率(ts)、多位点异交率(tm)、有效花粉供体数〔Nep=1/rp(m)〕、双亲近交系数(Ctm-ts)及父本相关性(rp)〔包括单位点[rp(s)]和多位点[rp(m)]相关性〕。其中Ctm-ts是双亲近交水平的估计,数值越大表明父母本个体之间的亲缘关系越近;rp是父本相关性的估计,表示的是一个家系中两个异交子代是全同胞(即两个异交子代共享同一个父本)的比例[29]。

2 结果与分析

2.1 南方红豆杉天然居群亲代的遗传多样性

从南方红豆杉天然居群亲代的遗传多样性情况可以看出(表3),两个参试居群亲代的有效等位基因数(Ne)、Shannon’s多样性指数(I)、等位基因丰富度(AR)和私有等位基因丰富度(PA)均值分别为4.192、1.508、3.886和1.740,ZJLQ居群的Ne、I、AR和PA要高于JXFY居群,分别为4.831、1.620、4.195和1.832。2个居群的近交系数皆大于零,且ZJLQ居群的近交系数(Fis=0.057)明显小于JXFY居群(Fis=0.171)。2个居群的观测杂合度(Ho)均小于期望杂合度(He),且固定指数(F)大于0,表现为杂合子缺失;此外,由引物S7在母株与子代中的扩增结果(图2)可知,母树的等位基因在子代个体中偶有缺失。ZJLQ居群的固定指数(F)为0.001,在理论上接近于0。

L. Marker (20～1 000 bp). M.采种母株mother plant;B1—B7.子代progenies。图2 引物S7在采种母株与子代中的扩增结果Fig. 2 The amplification products of primer S7 in part of mother plant and progenies

2.2 南方红豆杉天然居群的交配系统

对ZJLQ和JXFY居群的交配系统参数进行了估计(表4),结果表明:12个位点估算出的2个居群总的多位点异交率(tm)均为1.200,单位点异交率(ts)为0.932,双亲近交系数(Ctm-ts)为0.268,南方红豆杉自然居群的双亲近交水平较低。南方红豆杉自然居群中有效花粉供体数目(Nep)较少,仅为1.5。单位点父本相关性和多位点父本相关性的差值[rp(s)-rp(m)]反映双亲关联度与交配群体结构之间的关系,[rp(s)-rp(m)]为0.095,大于零,表明亲本间存在近亲关系。

表4 2个南方红豆杉天然居群的交配系统参数

3 讨 论

南方红豆杉是典型风媒传粉针叶树种,已有研究表明,南方红豆杉遗传多样性的物种水平(He= 0.638)以及种群水平(He= 0.468,Ho= 0.329)均较高[9, 23]。本研究中,参试的2个南方红豆杉天然居群的遗传多样性(He= 0.713,Ho= 0.647,I=1.508)皆较高,这可能是由于南方红豆杉曾广泛分布于北半球,具有较为丰富的遗传物质基础,幸存下来的南方红豆杉居群保留了祖先居群的大部分遗传变异。尽管该居群维持了较丰富的遗传多样性,但这些被地理隔离的斑块状天然小居群,随着繁殖世代推移,遗传漂变和近交衰退越来越明显[20]。对大多数天然小居群来说,近亲繁殖会导致后代纯合性的增加和杂合性的减少,因而降低居群的繁殖和生存能力[30]。南方红豆杉雌雄株间的花期不完全同步[2,31],导致居群内开花早的个体接受到的异源花粉概率降低,进而出现近交繁殖现象[32]。大多数天然小居群中近缘个体间交配是不可避免的,当经历一定繁殖世代,居群中每个个体都变成近缘,这种近亲交配会导致后代个体数目减少、不育或交配成功率低,极易引起居群生殖健康度下降,更容易灭绝[20]。

南方红豆杉的多位点异交率和单位点异交率都较高,表现为高度异交,这一结果与其他风媒针叶树种天然群体或人工群体的交配系统研究结果类似[33-35]。南方红豆杉雌雄异株间的花期不完全同步,也会导致其传粉受精受阻[31],这可能是南方红豆杉居群异交率高的主要原因[28]。参试的ZJLQ居群和JXFY居群的异交水平无差异,这与其在个体水平上的发现几乎一致。虽然南方红豆杉是以异交为主,但也存在极少数的雌雄同株或孤雌生殖的植株[2-3]。另外,早期胚胎发育阶段的近交衰退程度不同也可能是导致个体间异交率不同的原因[36]。早期的针叶树与红豆杉科植物类似,雌雄异株,但在漫长的适应性进化过程中,雌雄生殖结构逐渐融合形成两性植株[20],因而在其天然居群中可能会存在自交现象。ZJLQ和JXFY居群有效花粉供体数目均小于2,且父本相关性和有效花粉供体数差别较大,意味着南方红豆杉自然交配时亲本(父本)来源非常有限,这与各采种母株在居群内所处的位置及周围亲代植株的分布密度有关[32]。采种母株周边的成年雄性个体少、密度低、花期不遇,会导致有效花粉供体较少、父本相关性较高,且由于传粉限制,雌花不一定能充分接受到花粉,存在未授粉的雌花或授粉不充分的雌花。此外,生殖器官在发育过程中均会受到资源的限制,这种生殖的资源限制在高等植物中普遍存在。雌花受精后,胚胎发育受资源限制部分胚珠败育,不能发育为种子[37]。居群内的有效花粉供体若长期处于数目较少的状态时,会逐渐降低子代群体的遗传多样性,导致大量有害隐性基因的暴露、子代群体经济性状的下降乃至植物群体的衰亡[38]。母树接受的花粉库组成的多样性越高,越能提高子代的遗传变异,进而增强物种抵御群口数量波动和遗传变异的能力[39]。

在调查ZJLQ和JXFY居群过程中还发现,参试的ZJLQ居群中,幼苗及幼树占比较小,说明该居群中幼苗存活率较低,这可能是由于南方红豆杉在生长过程中,不同阶段对光照的需求度有明显差异,其需要经历严格的光照和水分因子选择压力[40]。ZJLQ居群中,老树个体的数量最多,中幼龄植株严重不足,属衰退型居群。虽然ZJLQ居群的参试亲代数量明显低于JXFY居群,但该居群中的雌株占比较大,有利于维持居群内的授粉成功率和遗传物质交换,因此ZJLQ居群的遗传多样性并不低于JXFY居群。JXFY居群中,幼树个体数量明显多于ZJLQ居群,且居群中也具有一定数量的幼苗,说明该居群中的生境有利于南方红豆杉种子萌发形成幼苗,如果加以人为的抚育措施,此类居群有望发展成为扩展型居群。

致谢中国林业科学研究院亚热带林业实验中心曾平生、姚甲宝、厉月桥、刘素贞和张利利等,浙江省龙泉市林业科学研究院冯建国、徐肇友和肖纪军等,福建省明溪红豆杉产业研究所余能健等在野外取样过程中给予了帮助。