细胞自噬在骨性关节炎发病中的作用研究进展

金恒凯 王瑞 汪正明 项思成 吕帅洁

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的退行性骨关节病，表现为关节疼痛、僵硬、肿胀和功能受限等，对患者的睡眠质量、心理健康、社会参与度等均有影响。据估计全球约有2.4 亿人患有症状性OA，但目前暂无药物能有效地逆转OA 的病理过程[1]。而细胞自噬是一种能将细胞内物质降解再利用的复合分子途径，在维持软骨细胞的存活和软骨基质的完整性等方面发挥重要作用，被视为OA 治疗的潜在靶点[2]。本文就细胞自噬在OA发病中的作用研究进展作一综述。

1 细胞自噬概述

细胞自噬是一种将细胞质物质（受损的细胞器、长寿命蛋白等）输送到溶酶体/液泡进行降解和循环利用的复合分子途径，主要分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬3 种形式[3]。其中巨自噬是最常见的细胞自噬类型，在应激因素的刺激下，细胞内依次形成双层膜结构的碗状吞噬泡、完全密闭的球状自噬体和自噬溶酶体，最后自噬溶酶体将包裹的内容物降解，降解产物回到细胞质内循环利用[4]。除非明确注明，在OA 领域的研究文献中所讲的细胞自噬指的就是巨自噬这一主要形式。细胞自噬现象在包括酵母菌和哺乳动物在内的真核生物中广泛存在。目前已经在酵母中筛选确定了40 多个自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG），在哺乳动物中也存在许多酵母ATG 的同源基因，其中以下几个ATG 编码的蛋白质在相关研究中出现较多：（1）微管相关蛋白1 轻链3（microtubul-associated protein 1 light chain 3，LC3）是ATG8的同源蛋白，膜结合形式的LC3-Ⅱ与胞质形式的LC3-Ⅰ的比值可反映细胞自噬水平的高低；（2）UNC-51 样激酶1（UNC51-like kinase 1，ULK1）是ATG1 的同源蛋白，参与自噬的启动并作为脚手架募集其他自噬相关蛋白，对ULK1 的检测可以反映自噬诱导的情况；（3）Beclin1 蛋白是ATG6 的同源蛋白，除了作为磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）复合体的亚基参与自噬调控外，其还能与B 细胞淋巴瘤-2 家族蛋白互作参与细胞凋亡的调控[5]。

2 细胞自噬与OA

2.1 软骨细胞自噬与OA 有研究表明软骨细胞自噬水平随衰老而逐渐降低，而细胞自噬水平的下降加速了OA 的两个典型病理过程：软骨细胞数目减少和软骨基质降解[6]。在OA 发病中软骨细胞自噬缺陷导致软骨细胞数目减少的机制是软骨细胞自噬清除受损的细胞器、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、长寿命蛋白、错误折叠的蛋白质的效率降低，能量代谢的紊乱、氧化应激的增多和凋亡相关基因的表达上调最终诱发软骨细胞凋亡[7]。Carames 等[2]发现人软骨细胞中ULK1、Beclin1 和LC3 等自噬相关蛋白的水平随细胞衰老而降低，而衰老软骨细胞的自噬缺陷诱发了OA 中的软骨细胞凋亡。Xin 等[8]研究发现磷酸酶和张力蛋白同源基因诱导激酶1/Parkin 通路介导的线粒体自噬能抑制OA 中ROS 的产生并提高人软骨细胞的存活率，表明线粒体自噬能有选择性地清除受到损伤或功能紊乱的线粒体以维持线粒体质量控制，避免软骨细胞因过度氧化应激而凋亡[9]。以上研究表明，软骨细胞自噬的激活有助于维持能量供应和能量代谢的稳定，并抑制OA 中的软骨细胞凋亡。

在OA 发病中软骨细胞自噬缺陷导致软骨基质降解的潜在机制是衰老软骨细胞分泌的炎症因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）增多，同时衰老软骨细胞的自噬水平下调导致清除致炎因子的能力下降，最终加速了软骨基质的降解[10-11]。Huang 等[12]发现人软骨细胞自噬的激活能降低软骨组织MMPs 水平并提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖水平，表明OA 中的软骨细胞自噬通过减少软骨组织的分解以保持软骨基质的完整性。Xue 等[13]发现IL-1β 诱导的炎症能抑制OA 大鼠的软骨细胞自噬，而上调衰老软骨细胞自噬能减轻炎症反应，提示细胞自噬的激活通过降解关节中的炎症介质、抑制OA 中炎症信号的转导起到软骨保护作用。以上研究表明，通过清除炎症因子、降低MMPs 的水平、减轻炎症反应，软骨细胞自噬减少了OA 中的软骨基质的降解。

还有研究发现细胞自噬在OA 各阶段产生的效应不尽相同。在短期的应激刺激下，OA 早期软骨细胞自噬水平上调，帮助细胞适应不良环境，抑制细胞凋亡；但在长期高于阈值的应激刺激下，细胞自噬可能参与诱导OA 晚期的软骨细胞转向凋亡[14]。此外，有研究认为酸敏感离子通道1a 通过激活细胞自噬加速了酸诱导的软骨细胞衰老，但由于细胞自噬过程中的溶酶体活性上调可能影响衰老检测中常用的β-半乳糖苷酶染色的准确性，这一结论仍存在争议[15-17]。

2.2 滑膜细胞自噬与OA 滑膜细胞可分为巨噬细胞样细胞（macrophage-like synoviocytes，MLS）和成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）。在OA发病过程中，软骨分解产物释放到关节滑液中，并被MLS 吞噬进而诱发滑膜炎症，炎症介质的增多又诱导MMPs 的过量产生加剧软骨降解，形成的正反馈机制加重了OA 的进展，而滑膜细胞自噬起到了阻断恶性循环、恢复关节内环境稳态的作用[18]。Ni 等[19]发现人类MLS 自噬水平下调导致炎性小体的激活和成熟IL-1β 的增多，表明滑膜巨噬细胞自噬可能通过降解炎症介质和抑制炎症小体的激活缓解OA 中的滑膜炎。而FLS 则能分泌长链透明质酸润滑关节，衰老FLS 产生的关节滑液减少是导致OA 中软骨磨损的重要原因。Chen 等[20]发现甲基转移酶样3 介导的N6-甲基腺嘌呤修饰通过降低ATG7 基因的表达导致FLS 自噬受损，而FLS 的自噬缺陷通过上调衰老基因GATA4 的表达加速FLS 衰老并最终促进OA 中的软骨降解，提示表观遗传修饰在OA 的FLS 自噬调控中发挥了重要作用。

2.3 细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）与OA EVs是一类细胞分泌或外膜脱落而成的囊泡状膜结构，可大致分为外泌体和微囊泡两大类，而生长板软骨细胞产生的钙化EVs 与OA 中的病理性软骨钙化密切相关[21-22]。Yan 等[23]的研究首次发现来源于软骨细胞含矿物质自噬体的LC3+钙化EVs 是启动颞下颌关节OA早期病理性软骨钙化的关键因素，并进一步阐明组蛋白去乙酰化酶6 介导的微管失稳导致了自噬通量受损引起了LC3+钙化EVs 的释放,这一全新的病理生理机制揭示了细胞自噬作为一种分泌过程在OA 的病理性软骨钙化中发挥关键作用。

2.4 成骨细胞/破骨细胞自噬与OA 成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收之间的不平衡是导致OA 中软骨下骨硬化、骨重塑异常和骨赘形成的关键因素[24]。Wan 等[25]发现人类成骨细胞中的15-脂氧合酶-1 通过抑制OA 中的成骨细胞自噬促进转化生长因子-β 的表达，导致软骨下骨结构的异常变化。Wang 等[26]发现OA 早期的成骨细胞自噬受损导致矿化减少，而上调细胞自噬能促进成骨细胞矿化以防止关节软骨退变，两项研究都表明了成骨细胞自噬参与维持软骨下骨结构的正常。目前破骨细胞自噬在OA 中的作用和分子机制尚不明确，Zhang 等[27]通过生物信息学分析鉴定出Beclin1、磷酸肌醇-3-激酶3 基因、GABA-A 受体关联蛋白样蛋白2 基因、ATG3 和ATG12 这5 个参与OA中破骨细胞自噬的关键基因，并通过体内和体外实验证实在小鼠OA 模型中自噬基因和破骨细胞活化之间存在高度相关性，这一研究从破骨细胞自噬的角度为OA 发病的分子机制提供了新的见解。

3 OA 中调控自噬的关键分子及信号通路

3.1 自噬调控关键分子

3.1.1 雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） mTOR 是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是OA 相关研究中最重要的自噬负性调控因子。mTORC1 对细胞自噬的负向调节作用主要是通过抑制ULK1/ATG13 蛋白的磷酸化和抑制转录因子EB 的活性实现的。在营养充足的情况下，上游的激素或生长因子通过PI3K/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）等信号通路的转导激活mTORC1，以促进合成代谢并抑制细胞自噬[28]；相反在营养缺乏的情况下，mTORC1 的活性降低，使得合成代谢被抑制而细胞自噬被激活。mTOR 接受Akt、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）、结节性硬化蛋白2（tuberous sclerosis protein 2，TSC2）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p53 蛋白、叉头框蛋白O（forkhead box O，FOXO）在内的众多上游信号分子的调控，是多条重要信号通路交汇的“枢纽”，在OA 的自噬调控中起到关键作用[29]。

3.1.2 沉默交配型信息调节因子2 同源蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog，Sirtuin/SIRT） Sirtuin 家族蛋白是一类NAD+依赖性脱乙酰酶[30]，哺乳动物的Sirtuin 家族蛋白有SIRT1～SIRT7 等7 个成员，它们的活性受上游的AMPK、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）等信号分子的调控[31]。Liao 等[32]发现SIRT1 能与ATG7 蛋白相互作用，诱导细胞自噬的激活以抑制软骨细胞的衰老和凋亡，表明SIRT1 能直接与ATG 编码的蛋白结合诱导软骨细胞自噬。Lu 等[33]发现SIRT1 能通过去乙酰化下调磷酸酶及张力蛋白同源物基因的表达进而抑制表皮生长因子受体的泛素化，激活小鼠软骨细胞自噬从而延缓OA 进展，表明OA 发病中SIRT1 还能通过乙酰化调控自噬相关的酶/转录因子的活性。此外，Xu 等[34]还发现另一个定位于线粒体的Sirtuin 家族蛋白SIRT3 能通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活软骨细胞自噬起到软骨保护作用。

3.1.3 FOXO 蛋白家族 FOXO 蛋白家族在哺乳动物中有4 个成员：FOXO1、FOXO3a、FOXO4 和FOXO6，其中FOXO1 和FOXO3a 是软骨细胞自噬激活的关键诱导因子[35]。Akasaki 等[36]发现下调软骨细胞中FOXO1/3 的表达能引起自噬相关蛋白的减少,增加氧化应激诱导软骨细胞凋亡的敏感性，提示OA 发病中FOXO 蛋白可能通过促进ATG 的转录激活细胞自噬，以帮助软骨细胞对抗氧化应激。Kuwahara 等[37]发现FOXO3 通过促进人软骨细胞内C10orf10 基因/孕酮诱导的蜕膜蛋白（decidual protein induced by progesterone，DEPP）的表达激活线粒体自噬，表明FOXO 蛋白还参与线粒体自噬以维持软骨细胞的线粒体质量控制。

3.1.4 非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA） ncRNA是指不编码蛋白质的RNA，在细胞自噬调控领域被研究最多的非编码RNA 是microRNA，miRNA、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）。miRNA 是指长度为19～25个核苷酸的小分子RNA，它能通过与靶mRNA 转录本的3'TU 互补配对沉默靶基因。研究表明，许多不同的miRNA 通过降解mRNA、抑制蛋白翻译等方式参与OA中的自噬调控[38]。Kim 等[39]发现miR-126-5p 通过与过氧化物酶体增殖受体γ 辅激活因子α（peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator α，PGC-1α）非翻译区结合抑制PGC-1α 的表达激活软骨细胞线粒体自噬，提示miRNA 具有靶向软骨细胞自噬以治疗OA的临床潜力。

lncRNA 指的是长度＞200 个核苷酸的ncRNA，其通过调控靶基因表达、干扰mRNA 的剪切、调节蛋白质的活性等多种方式调控OA 中的细胞自噬。Wen等[40]发现lncRNA KLF3-AS1 能通过激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路抑制软骨细胞的自噬，Tian 等[41]发现lncRNA 小核仁RNA 宿主基因7 能通过与miR-34a-5p竞争性结合调控滑膜蛋白1 基因的表达从而影响OA中的软骨细胞自噬，表明lncRNA 可以通过与miRNA结合间接参与OA 中细胞自噬的调控。

circRNA 则是由反式剪接产生的共价闭合的RNA。Man 等[42]发现Ras 同源基因家族成员T1 能抑制miR-142-5p 与靶基因的结合，促进细胞周期蛋白D1基因的表达从而下调软骨细胞自噬水平，表明circRNA 能作为miRNA 海绵间接调控miRNA 靶基因的表达，进而参与OA 中的细胞自噬调控。

3.2 自噬调控信号通路

3.2.1 PI3K/Akt/mTOR 信号通路 PI3K/Akt/mTOR 信号通路是OA 相关研究中受关注最多的信号通路。PI3K 可分为Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类,目前对Ⅰ类PI3K 的研究最为透彻。生长因子、胰岛素等细胞外刺激能通过刺激酪氨酸激酶受体和G 蛋白偶联受体激活Ⅰ类PI3K，之后Ⅰ类PI3K 通过活化Akt蛋白激活下游的mTORC1，并最终抑制OA 中的细胞自噬[43]。Shi 等[44]发现泛素样含PHD 和环指域蛋白1 可通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路增强细胞自噬以减少OA 中的软骨细胞凋亡，提示表观遗传调节因子在OA 发病中参与调控软骨细胞凋亡。

3.2.2 AMPK/mTOR 信号通路 AMPK 是一种具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的异源三聚体蛋白复合物，能通过监测AMP 比ATP 和ADP 比ATP 的比例感知细胞中的能量变化[45]。AMPK 不仅能直接磷酸化ULK1/2 促进细胞自噬[46]，还能通过多种途径抑制下游的mTOR 从而激活细胞自噬。Li 等[47]发现中等强度运动通过嘌呤能离子通道型受体7/AMPK/mTOR 信号轴促进软骨细胞自噬以避免细胞焦亡，提示OA 中运动疗法能激活软骨细胞自噬。Wang 等[48]发现高血糖不仅能通过AMPK/mTOR 通路抑制软骨细胞自噬，还能诱发软骨细胞的氧化应激导致细胞自噬水平上调，这项研究揭示了高血糖对软骨细胞自噬的双重效应，为骨关节炎合并糖尿病的患者提供了新的用药策略。

3.2.3 TSC/脑Ras 同源蛋白（ras homolog enriched in brain，Rheb）/mTOR 信号通路 结节性硬化症蛋白复合体（tuberous sclerosis protein complex，TSCC）能通过将Rheb 从活性形式转化为非活性形式，抑制mTORC1活性从而激活OA 中的细胞自噬[49]。Lv 等[50]发现槲皮素通过介导TSC2/Rheb/mTOR 信号通路诱导小鼠软骨细胞自噬以缓解OA，表明利用天然生物活性物质激活TSC/Rheb/mTOR 通路诱导软骨细胞自噬是具有较大潜力的OA 治疗方式。

4 小结与展望

目前OA 仍是骨科临床治疗的难题。而近年来的研究发现，通过抑制细胞凋亡、减轻炎症反应、维持能量稳态、维持骨代谢平衡，适度的细胞自噬不仅在OA发病中减缓软骨降解，还参与纠正各组织内存在的代谢紊乱，表明以细胞自噬为靶点的药物和疗法具有良好的发展潜力。

但将自噬激活剂转化为临床用药仍有许多障碍。在生物学机制方面，细胞自噬在OA 发病不同阶段的作用机制仍未阐明，细胞自噬上下游复杂的分子调控网络仍有待厘清；在药物开发方面，许多自噬诱导剂的不良反应明显，目前尚缺乏能精准调控软骨细胞自噬的靶向药物；在临床试验方面，目前的研究主要采用动物模型和细胞体外实验，缺乏高质量的临床试验数据以有力地证明相关疗法的有效性。因此，对OA 中自噬的作用机制做更深入的研究、以自噬为靶点寻找和开发适用于临床的OA 治疗药物、开展相关药物和疗法的多中心大样本随机双盲对照试验十分必要。