高良姜-香附提取纯化工艺的研究*

黄玉芳，谭银丰，李永辉，戴初雄，唐伟森，李海龙

(1 海南医学院，海口市黎族医药重点实验室，海南 海口 571199；2 海南寿南山参业有限公司，海南 海口 570100)

良附方出自《良方集腋》，高良姜性辛热，功效可温胃散寒，香附性辛甘，功效可疏肝解郁、理气宽中[1]，二者常用于治疗胃炎、胃溃疡、胃癌等。高良姜是姜科山姜属植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根茎，其主要化学成分有黄酮类、挥发油类和二芳基庚烷类[2]等。现代药理学研究表明[3-4]，高良姜具有抗氧化、抗炎镇痛、抗溃疡、抗菌等药理作用。香附为莎草科植物莎草(CyperusrotundusL.)的干燥根茎，其化学成分有挥发油类、黄酮类、生物碱类、三萜及甾醇类，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗抑郁等优秀的药理作用[5]。

大孔树脂是一种有机高聚物吸附剂，具有成本低、吸附量大、易洗脱、可再生利用等优点，常被用于中药的分离纯化[6]。大多数黄酮类成分呈弱极性，因此纯化黄酮类成分目前以AB-8、D101、HPD类居多[7-9]。

1 材料与仪器

Prominence UFLC液相色谱仪，日本岛津公司；通过Turbo V离子源接口串联AB‐SCIEX API 4000+串联四级杆质谱仪，Analyst软件控制数据采集和处理，美国AB公司；XS105DU十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；Lab Tower EDI15超纯水系统，赛默飞公司；KQ‐100v型超声波清洗器，昆山市超声仪有限公司；甲醇和甲酸，阿拉丁控股集团有限公司；乙腈，默克股份两合公司；超纯水(自制)；高良姜素、山奈素和α-香附酮，成都曼斯特生物科技有限公司；诺卡酮，天津希恩思生化科技有限公司；另外DPHA(5-羟基-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)-1-苯-3-庚酮)、DPHB(7-(4′-羟基-3′-甲基苯基)-1-苯庚基-4-烯-3-酮)和DPHC(5-羟基-1，7-双苯-3-庚酮)(对照品)，海南医学院重点实验室提供(自制)；高良姜和香附药材，海南寿南山参业有限公司；AB-8树脂、D101树脂，西亚试剂；HPD600树脂，源叶生物。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件

Kinetex®XB-C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，2.6 μm)，柱温40 ℃，流速0.35 mL/min，进样量3 μL，流动相为乙腈(A)-0.2%甲酸水(B)，洗脱梯度(0～1.5 min，10%A；1.5～4.5 min，10%～90%A；4.5～5.5 min，90%A；5.5～6 min，90%～10%A；6～7 min，10%A)见图1。

图1 对照品LC-MS/MS色谱图(A)和供试品LC-MS/MS色谱图(B)Fig.1 LC-MS/MS chromatogram of reference solution (A) and LC-MS/MS chromatogram of test solution (B)

2.1.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子电离模式，碰撞气4 psi，帘气35 psi，GS1和GS2均为50 psi，喷雾电压5 500 V，喷雾温度550 ℃，多反应离子监测(MRM)参数见表1。

表1 化合物优化多反应离子监测(MRM)参数Table 1 Multi-reaction monitoring(MRM)parameters for each compound optimization

2.1.3 溶液的制备

对照品溶液的制备 精密称取高良姜素、山奈素、α-香附酮、诺卡酮、DPHA、DPHB、DPHC对照品1 mg加1 mL甲醇得标准储备液，用甲醇稀释配制成10、20、50、100、200、500、800、1 000、1 250 ng/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备 精密称定浸膏5 mg，加1 mL甲醇超声30 min溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，上样分析前，将其稀释100倍。

2.1.4 线性范围

取不同浓度的混合对照品溶液，按质谱条件进行测定，以峰面积平均值为纵坐标，浓度为横坐标计算7个成分的回归方程，线性范围：10～1 250 ng/mL，结果见表2。

表2 7个成分的回归方程、相关系数Table 2 Regression equation and correlation coefficient of 7 components

表3 正交试验考察结果Table 3 Results of orthogonal test

表4 综合评分方差分析Table 4 Analysis of variance of comprehensive score

2.1.5 精密度、稳定性、重复性

取某一质量浓度的混合对照品溶液，按质谱条件分别连续进样6次，计算山奈素、高良姜素、诺卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的峰面积RSD分别为7.36%、3.94%、1.89%、6.21%、9.19%、2.29%、1.66%，表明仪器精密度良好。取一批样品，按2.1.3项下制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h，计算山奈素、高良姜素、诺卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的浓度RSD分别为5.82%、3.19%、7.54%、13.03%、11.16%、8.45%、14.68%，表明各成分在24h内稳定。平行制备6份供试品溶液，计算山奈素、高良姜素、诺卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的含量(mg/g)分别为2.50、10.98、1.17、0.81、2.68、4.82、2.41，RSD为6.34%、2.21%、4.73、5.15%、9.22%、4.59%、8.95%。

2.1.6 加样回收率

按2.1.3供试品溶液制备项下，平行制备6份，加入已知浓度的各对照品适量，进样测定，计算回收率，山奈素、高良姜素、诺卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的平均加样回收率分别为94.73%、109.10%、91.09%、107.94%、102.81%、116.51%、111.21%，RSD分别为9.46%、6.49%、9.81%、10.74%、8.20%、1.31%、8.72%，说明该方法准确可靠。

2.2 提取工艺

2.2.1 正交实验设计

参考文献[10]，选取醇浓度(A)：50%、70%、90%，提取时间(B)：1 h、1.5 h、2 h，料液比(C)：1∶6、1∶8、1∶10，提取次数(D)：1次、2次、3次，分别设3个水平。称取高良姜-香附药材各100 g，按正交设计进行实验。采用多指标综合评分法，权重系数分别为出膏率(0.50)、高良姜素(0.05)、山奈素(0.05)、诺卡酮(0.10)、α-香附酮(0.15)、DPHA、DPHB、DPHC均为0.05进行综合评分。

综合评分=0.50Dij+0.05Dij+0.05Dij+0.10Dij+0.15Dij+0.05Dij+0.05Dij+0.05Dij(Xij表示第i次试验中第j个指标的测定值，Dij表示第j个指标下第i个测定值的标准化数据(Dij= Xij/(Xj)max，其中i=1，2，…，9；j=1，2，3，4，5，6，7，8)。

根据结果可知，醇提最优工艺条件为A2B3C3D2，即醇浓度70%，提取时间2 h，料液比1∶10，提取次数2次。影响提取工艺的影响因素大小顺序为醇浓度>提取时间>料液比>提取次数。由于料液比为1∶8和1∶10其均值相差仅为0.018，最终确定其最优工艺为A2B3C2D2，即条件为70%乙醇，提取时间2 h，料液比1∶8，提取次数2次。

2.2.2 验证实验

按优化条件进行3批验证实验，结果见表5，说明该工艺条件稳定可行。

表5 验证实验结果Table 5 Result of verification experiment

2.3 大孔树脂纯化工艺

2.3.1 筛选大孔树脂类型

参考文献[11]，称取预处理好的D101型(非极性)、AB-8型(弱极性)、HPD-600型(极性)大孔树脂各5 g，于具塞锥形瓶中，加入浓缩好的提取液50 mL，室温下于摇床上振摇2 h后取上清液，测定7个成分的浓度，计算各树脂的吸附率。将多余的上清液弃掉，各加入50 mL95%的乙醇，室温下于摇床上振摇2 h，取上清液，测定7个成分的浓度，计算解吸率，见表6。

表6 大孔树脂类型考察Table 6 Investigation of macroporous resin types

由表6可知，DPH-600型大孔树脂吸附能力较其它两种略差，D1010型和AB-8型大孔树脂对7个成分的吸附能力相差不大，但D101型的解吸能力较AB-8型差。因此，选择AB-8型大孔树脂作为纯化填料。

2.3.2 上样浓度

称取高良姜-香附各100 g，按正交实验优化的最佳工艺进行提取，取三份400 mL提取液按1/2、3/8、1/4进行浓缩，将浓缩液静置过夜，过滤，测各浓缩液中7个成分的含量，见图2。

图2 上样浓度对纯化效果的影响Fig.2 Effect of sample concentration on purification efficiency

由图2可知，随着浓缩比例的增加，乙醇浓度不断减小，7个成分的含量均有所下降，浓缩比例为1/4时各成分的含量明显较低，浓缩比例为1/2和3/8时各成分含量相差不大，均占原提取液的50%以上，但由于浓缩比例为3/8时浓缩液比较浑浊，对于后续实验操作造成麻烦，为提高效率，选择1/2浓缩液作为上样液，酒精计测得此时的醇浓度为40%，浓缩液质量浓度为0.15 g/mL。

2.3.3 最大上样量

称取大孔树脂5.0 g，预处理后，湿法装柱，柱体积约10 mL，将浓缩好的提取液每10 mL一份，按1 BV·h-1的流速上样，10 mL收集一份流出液，共收集10份，测定流出液中7个成分的含量，绘制泄漏曲线，见图3。

图3 AB-8大孔吸附树脂提取液泄漏曲线Fig.3 Leakage curve of extract solution of AB-8 macroporous resin

流出液浓度比上样液浓度超出10%即认为泄漏。40%醇浓度药液作为上样溶液，上样份数达到8份时，流出液中检测到DPHA泄漏，表明达最大上样量。说明5 g AB-8大孔吸附树脂的最大上样量约为80 mL，根据上样浓度计算可得80 mL上样液相当于生药量12 g，故AB-8大孔吸附树脂用量与生药量的质量比为1∶2.4。

2.3.4 上样流速

取预处理好的5 g AB-8大孔树脂三份，取1/2浓缩液各80 mL分别以2、4、6 BV·h-1的流速上样，收集流出液，计算总平均浓度，见图4。

图4 上样流速对纯化效果的影响Fig.4 Effect of sampling speed on purification efficiency

由图4可知，随着上样流速越慢，有效成分能被更多的吸附保留，流速为6 BV·h-1和4 BV·h-1，测得流出液中成分很高，2 BV·h-1测得流出液成分很低，未超出上样液的10%，并且其和考察最大上样量时的上样流速1 BV·h-1一样，上样量可达80 mL才泄露，故确定上样流速为2 BV·h-1。

2.3.5 洗脱醇浓度

上样完成后，静置10 min，用纯水洗脱至流出液变澄清，再依次用40%、60%、80%、95%的醇进行洗脱(每个梯度洗脱5份，每份10 mL)，洗脱流速12 BV·h-1，收集每份洗脱液，测定7个成分的含量，见图5。

图5 洗脱醇浓度对纯化效果的影响Fig.5 Effect of eluting alcohol concentration on purification efficiency

大多数成分在洗脱浓度为60%时达最大泄漏，但α-香附酮和DPHB在醇浓度为80%时才达最大泄漏，因此，为了能够更好的富集每个成分，最终选择80%的乙醇作为洗脱剂。

2.3.6 验证实验

为确定AB-8大孔树脂纯化工艺的稳定可行性，对上述纯化工艺进行验证，取醇浓度为40%的浓缩液进行上样，上样流速为2 BV·h-1上样，分别用40%、80%和95%的乙醇进行洗脱，洗脱流速为12 BV·h-1，测定7个成分的含量，绘制洗脱曲线，见图6。

图6 纯化工艺验证Fig.6 Verification of purification process

从图6中可看出7个成分在AB-8大孔数脂上能很好的被富集，在乙醇浓度为80%时，能很好的被洗脱，3次平行试验均证实了大孔吸附树脂能很好的吸附纯化高良姜-香附药对中的主要化学成分。各成分的总含量平均为57.68%，RSD分别为8.16%、3.74%、2.11%、7.21%、1.84%、7.80%、11.25%。

3 结 论

本研究选择的7个成分为高良姜-香附中最具代表性的活性成分，但目前有关高良姜-香附的提取工艺考察指标侧重于挥发油类和黄酮类[12]，尤其是高良姜素和α-香附酮。二芳基庚烷类化合物是高良姜中的代表性成分之一，有文献表明[13]，高良姜中的二芳基庚烷类化合物具有镇痛[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、抗氧化[17]等确切的药理活性。但有关该药对的提取工艺中并未涉及此类化合物，其纯化工艺更未见报道。

本研究确定高良姜-香附的最佳提取工艺条件为：醇浓度为70%乙醇，料液比为1∶8，提取次数为2次，每次2 h；纯化工艺为40%醇浓度上样液通过AB-8型大孔树脂柱，生药量：树脂量1∶2.4，上样流速2 BV·h-1，洗脱醇浓度为80%乙醇。在验证实验中，提取物的总含量平均为13.12%，纯化后为57.68%，该提取纯化工艺条件合理，稳定可行，并且为高良姜-香附的开发利用提供可能。