屎肠球菌发酵玉米粉条件参数优化

■ 杨 成 朱振宇 王明根 白天天 俄广旭 卢 冬，2 郭雪峰，2*

（1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

玉米是畜牧业中广泛使用的能量饲料之一，其含有丰富的营养物质，如不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素E、维生素B1等物质，具有调节机体神经系统[1]、促进肠道的蠕动等功能[2]，可作为发酵饲料制作的碳源物质[3]。微生物发酵可以改善饲料品质[4-5]，能够通过自身产生的酶将饲料中的大分子物质降解为小分子物质，进而提高饲料利用率[6]。微生物发酵的关键在于菌种，菌种的特性决定了发酵饲料的效果[7]。乳酸菌是发酵饲料的主要菌种，通过发酵产生乳酸，降低饲料pH，抑制腐败微生物的生长，减少发酵过程中的蛋白质水解和干物质损失[8]。屎肠球菌是一种兼性厌氧革兰氏阳性菌乳酸菌，属于肠球菌属，具有抑制病原菌、稳定胃肠道正常菌群、维持微生态平衡、改善胃肠道功能、提高机体免疫力、提高食物消化率和生物效价，提高饲料中粗蛋白含量、降低饲料中中性洗涤纤维含量等功能[9-12]。乳酸菌发酵玉米粉是将玉米淀粉作为主要的碳源物质，将玉米中的含氮物质作为氮源[13]。目前，关于屎肠球菌在发酵饲料中的应用鲜有报道，本研究以屎肠球菌F11.1G 为菌种，添加到玉米粉中进行发酵基础液制备和发酵参数优化，旨在为益生菌发酵玉米产酸工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

屎肠球菌F11.1G 为郭雪峰团队自主分离鉴定，于中国典型培养物保藏中心保藏(保藏号：M 2020793)。屎肠球菌培养使用Man，Rogasa and Sharpe(MRS)培养基，pH 为6.8，使用方法参考国标。玉米购买自新疆天康饲料有限公司。

1.2 试验方法与设计

1.2.1 发酵母液的制备

锥形瓶中加入100 mL 纯化水，后加入0.5 g 乳糖充分溶解，待乳糖溶解后在溶液中加入0.001 g 柠檬酸，用于调节溶液pH。将混匀后的溶液121 ℃高压15 min，待温度冷却后将高压完的溶液移入超净工作台，加入0.5 g屎肠球菌冻干粉，在恒温培养箱37 ℃下发酵72 h，测得屎肠球菌活菌数为1×108CFU/mL，用于制作发酵玉米粉的屎肠球菌冻干粉菌活性达标[14]。

1.2.2 种子发酵液的制备

将上述制备好的发酵母液取50 mL 与950 mL 纯化水制备成1 L 浓度为5%的发酵液，按此原理分别制备浓度为10%、15%、20%和25%的发酵液各1 L。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验设计

取15 个1 L 发酵罐分别装300 g 玉米粉，料液比1∶1，调节种子发酵液的pH 为7.0，将接种量为5%、10%、15%、20%和25%的种子发酵液与玉米粉混合，搅拌均匀，密封后在恒温培养箱30 ℃条件下发酵48 h，每个处理3 个重复。发酵结束测定发酵玉米粉中屎肠球菌菌活和pH。探究接种量对发酵玉米粉中屎肠球菌菌活和pH的影响。

取15 个1 L 发酵罐分别装300 g 玉米粉，接种量为5%，调节种子发酵液的pH 为7.0，料水比分别为1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4，将发酵液与玉米粉混匀、密封后在恒温培养箱30 ℃条件下发酵48 h，每个处理3 个重复。发酵结束测定发酵玉米粉中屎肠球菌活性和pH。探究料水比对发酵玉米粉中屎肠球菌活性和pH的影响。

取18 个1 L 发酵罐分别装入300 g 玉米粉，接种量5%，料液比为1∶1，调节种子发酵液的pH 为7.0，将发酵液与玉米粉混匀、密封后在恒温培养箱30 ℃条件下发酵，发酵时间分别为12、24、36、48、60、72 h，每个处理3 个重复。发酵结束测定发酵玉米粉中屎肠球菌活性和pH。探究发酵时间对发酵玉米粉中屎肠球菌活性和pH的影响。

取15 个1 L 发酵罐分别装300 g 玉米粉，料液比1∶1，调节种子发酵液的pH为7.0，接种量为5%，将发酵液与玉米粉混匀、密封后在恒温培养箱中发酵，发酵时间48 h，发酵温度分别为25、30、35、37、40 ℃，每个处理3个重复。发酵结束后测定玉米粉的菌活和pH。探究温度对屎肠球菌发酵玉米粉菌活和pH的影响。

1.3.2 屎肠球菌发酵玉米粉最佳条件参数试验设计

在单因素试验结果的基础上，选择适宜接种量、料水比、发酵时间和发酵温度4 个条件参数进行优化，每个条件设计3 个水平，采用L9(34)正交表进行正交试验。

1.3.3 测定指标和方法

发酵玉米粉中屎肠球菌活性的测定：平板涂布法[15]。

可溶性糖（WSC）的测定：采用硫酸-蒽酮比色法[16]。

pH 的测定：采用四分法称取各处理组样品25 g，加入225 mL 无菌超纯水，4 ℃过夜浸泡，四层纱布过滤后用pH计测定样品pH。

测定挥发性脂肪酸的测定：采用U1-timate 3000型高效液相色谱仪测定（赛默飞世尔上海仪器有限公司）；参考郁万瑞等[17]方法测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量。

1.4 数据处理

每组数据3 次重复，结果以“平均值±标准差”来表示，试验数据通过Microsoft Excel、SPSS 22.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 屎肠球菌发酵玉米粉单因素试验结果分析

2.1.1 接种量对屎肠球菌发酵玉米粉pH 和屎肠球菌活性的影响

如表1 所示，随着发酵母液接种比例的增加，发酵玉米的pH 呈先上升后下降的趋势。当接种量为5%时，pH 低（pH=4.03），接种量20%时pH 达到最高（pH=4.17）。菌活随着接种量的比例增大呈上升趋势。当接种量为25%时，菌活最高为9.93×109CFU/mL；接种量为10%时，菌活最低为5.80×109CFU/mL。本试验中接种量5%与15%、20%，各组之间pH 差异显著（P＜0.05）；接种量为20%与25%两组之间差异显著（P＜0.05）。各组接种比例的菌活呈上升趋势，但差异均不显著（P＞0.05）。

表1 发酵母液接种量对屎肠球菌发酵玉米粉pH和屎肠球菌活性的影响

2.1.2 料水比对屎肠球菌发酵玉米粉pH和屎肠球菌活性的影响

如表2 所示，随着接种料水比例的增加，发酵玉米的pH 呈先下降后上升的趋势。当料水比为1∶1时，pH 最低（pH=3.60）；当料水比为1∶0.6 时，pH 最高（pH=4.04），显著高于其余4 组。屎肠球菌活性随着料水比的增加呈上升趋势，但差异不显著（P＞0.05）。当料水比为1：1.4 时菌活达到最高，为2.32×109CFU/mL，当料水比为1∶0.6 时菌活最低为1.08×109CFU/mL。

表2 料水比对屎肠球菌发酵玉米粉pH和屎肠球菌活性的影响

2.1.3 发酵时间对屎肠球菌发酵玉米粉pH 和屎肠球菌活性的影响

如表3 所示，随着发酵时间延长，发酵玉米粉的pH 呈下降的趋势。当发酵时间为12 h 时发酵饲料pH 最高（pH=6.04），显著高于其余各组（P＜0.05），发酵时间为72 h 时，pH 最低（pH=3.39）。屎肠球菌活性随着发酵时间的延长呈先上升后下降的趋势，但各组屎肠球菌菌活差异均不显著（P＞0.05）。发酵时间为48 h 时，菌活最高为4.00×109CFU/mL；发酵时间为12 h时，菌活最低为0.31×109CFU/mL。

表3 发酵时间对屎肠球菌发酵玉米粉pH和屎肠球菌活性的影响

2.1.4 发酵温度对屎肠球菌发酵玉米粉pH 和屎肠球菌活性的影响

如表4 所示，随着发酵温度的升高，发酵玉米粉的pH 呈缓慢下降再上升的趋势；发酵温度为37 ℃时，发酵玉米粉的pH 最低（pH=3.33），发酵温度为35 ℃时，发酵玉米粉pH 最高（pH=3.51）。发酵温度为37 ℃时，pH 显著低于25 ℃和35 ℃（P＜0.05），和其余组差异不显著。屎肠球菌活性随着发酵温度的升高呈先上升后下降的趋势，但差异不显著（P＞0.05）。发酵温度为30 ℃时，菌活最高为6.84×109CFU/mL，发酵温度为25 ℃时，菌活最低为3.96×109CFU/mL。

2.2 屎肠球菌发酵玉米粉产酸的正交试验结果及分析

通过单因素确定的各因素发酵条件，发酵过程中各因素之间可能存在交互作用。为进一步研究各因素对屎肠球菌发酵玉米产酸的影响，采用L9(34)正交试验设计对发酵参数进行优化，正交试验设计见表5。

表5 屎肠球菌发酵玉米粉正交试验因素水平

2.2.1 不同发酵因子对发酵玉米粉菌活的影响

L9(34)正交试验分析结果见表6～表12，R值越大，该因素对试验结果影响越大。表6 中屎肠球菌发酵玉米粉中各因素影响菌活顺序为：发酵时间（C）＞接种量（A）＞料水比（B）＞发酵温度（D）。发酵时间是主要影响因素，其次是接种量和料水比，发酵温度对玉米发酵过程中菌活性的影响最小。基于以上分析确定在发酵玉米粉的过程中影响菌活性的发酵条件参数为：A2（15%）B1（1：0.8）C1（24 h）D1（30 ℃）/A2（15%）B3（1：1.4）C1（24 h）D1（30 ℃），即接种量：15%，料水比：1：0.8，发酵时间：24 h，发酵温度：30 ℃；或接种量：15%，料水比：1∶1.4，发酵时间：24 h，发酵温度：30 ℃。该条件下适合屎肠球菌生长。

表6 不同发酵因子对菌活性的影响

2.2.2 不同发酵因子对发酵玉米粉可溶性糖的影响

表7 中屎肠球菌发酵玉米粉中各因素影响可溶性糖含量的顺序为：接种量（A）＞发酵时间（C）＞发酵温度（D）＞料水比（B）。发酵过程中影响可溶性糖的主要影响因素是接种量，料水比的影响最小。基于上述结果确定发酵玉米粉过程中影响可溶性糖含量的发酵条件参数为：A1（5%）B2（1∶1.2）C1（24 h）D3（40 ℃），即接种量：5%，料水比：1∶1.2，发酵时间：24 h，发酵温度：40 ℃。在此条件下可溶性糖的含量较低。

表7 不同发酵因子对可溶性糖的影响

2.2.3 不同发酵因子对发酵玉米粉pH的影响

表8 中屎肠球菌发酵玉米粉中各因素影响pH 的顺序为：发酵时间（C）＞料水比（B）＞发酵温度（D）＞接种量（A）。发酵过程中影响pH 的主要影响因素是发酵时间，其次是料水比和发酵温度，接种量对玉米发酵过程中对pH 的影响最小。基于以上结果确定发酵玉米粉的过程中影响pH 的发酵条件参数为：A3（25%）B3（1∶1.4）C3（72 h）D2（37 ℃），即接种量：25%，料水比：1∶1.4，发酵时间：72 h，发酵温度：37 ℃。在此条件下pH较低。

表8 不同发酵因子对pH的影响

2.2.4 不同发酵因子对发酵玉米粉乳酸的影响

表9 中屎肠球菌发酵玉米粉中各因素影响乳酸含量的顺序为：发酵时间（C）＞接种量（A）＞料水比（B）＞发酵温度（D）。发酵过程中影响乙酸含量的主要影响因素是发酵时间，其次是发接种量和料水比，温度对玉米发酵过程中乳酸影响最小。基于以上结果确定在发酵玉米粉过程中影响乳酸的发酵条件参数为：A3（25%）B3（1∶1.4）C2（48 h）D2（37 ℃），即接种量：25%，料水比：1∶1.4，发酵时间：48 h，发酵温度：37 ℃。在此条件下乳酸含量较高。

表9 不同发酵因子对乳酸的影响

2.2.5 不同发酵因子对发酵玉米粉乙酸的影响

表10 中屎肠球菌发酵玉米中各因素影响乙酸含量顺序为：发酵时间（C）＞接种量（A）＞发酵温度（D）＞料水比（B）。发酵过程中影响乙酸含量主要影响因素是发酵时间，其次是接种量和温度，料水比对发酵过程中乙酸含量影响最小。基于以上结果确定在发酵玉米粉的过程中影响乙酸的发酵条件参数为：A3（25%）B1（1∶0.8）C1（24 h）D1（30 ℃），即接种量：25%，料水比：1∶0.8，发酵时间：24 h，发酵温度：30 ℃。在此条件下乙酸含量较高。

表10 不同发酵因子对乙酸的影响

2.2.6 不同发酵因子对发酵玉米粉丙酸的影响

表11 中屎肠球菌发酵玉米粉中各因素影响丙酸含量的顺序为：发酵时间（C）＞料水比（B）＞接种量（A）＞发酵温度（D）。发酵过程中影响丙酸含量的主要影响因素是发酵时间，其次是料水比和接种量，发酵温度对玉米发酵过程中丙酸的影响最小。基于以上结果确定在发酵玉米粉过程中影响丙酸的发酵条件参数为：A3（25%）B3（1∶1.4）C2（48 h）D2（37 ℃），即接种量：25%，料水比：1∶1.4，发酵时间：48 h，发酵温度：37 ℃。在此条件下丙酸含量较低。

表11 不同发酵因子对丙酸的影响

2.2.7 不同发酵因子对发酵玉米粉丁酸的影响

表12 中屎肠球菌发酵玉米中各因素影响丁酸含量顺序为：发酵时间（C）＞发酵温度（D）＞料水比（B）＞接种量（A）。发酵过程中影响丁酸含量的主要影响因素是发酵时间，其次是发酵温度和料水比，接种量对玉米发酵过程中丁酸的影响最小。基于以上结果确定在发酵玉米粉的过程中影响丁酸的发酵条件参数为：A3（25%）B1（1∶0.8）C1（24 h）D1（30 ℃），即接种量：25%，料水比：1∶0.8，发酵时间：24 h，发酵温度：30 ℃。在此条件下丁酸的含量较低。

表12 不同发酵因子对丁酸的影响

2.2.8 各因素主次顺序

表13 中筛选本试验最优参数时，根据正交试验设计原则需对各因素进行分析。因素A：从主次顺序表中和初选最优水平中可知，A对可溶性糖的影响排在第一位，屎肠球菌活性、乳酸和乙酸的影响排在第二位，属主要因素；丙酸的影响排在第三位，属次要因素。所以所选水平应以主要因素的指标来考虑。可溶性糖在A1水平时效果最好，菌活在A2水平时最好，乳酸、乙酸、丙酸和丁酸在A3水平时效果最好，但在A1水平时其余指标与A3水平时相差不大，故A应取A3。因素B：从主次顺序表中可见，菌活性、乳酸和丁酸均排在第三位，乙酸排在第四位，属次要因素。pH的影响排在第二位，可溶性糖的影响排在第四位，所以，应以pH 这一指标来考虑。从初选最优水平组合中可知，对pH 选B3为好，故B应取B3。因素C：从主次顺序表中和初选最优水平中可知，C对7 个指标影响排在第一位，属主要因素，菌活性、可溶性糖、乳酸、乙酸和丁酸等指标在C1时最好，乙酸和丙酸在C2时效果最好，但在C2水平时其余指标与C1水平时相差不大，同理菌活和pH 应选择C1，故C 应取C1。因素D：对丁酸的影响排在第二位，pH 和可溶性糖的影响排在第三位次要因素，乙酸排在第三位，其余指标排在第四位属。对丁酸而言，选D1较好，故D应选D1。

表13 屎肠球菌发酵玉米产酸各因素主次顺序表

2.2.9 验证试验

通过屎肠球菌发酵玉米粉的条件参数优化，得出结论屎肠球菌为发酵玉米粉最佳条件为A3B3C1D1：接种量为25%、料水比为1∶1.4、发酵时间24 h、发酵温度30 ℃。将试验所得到的最佳条件参数进行验证。试验结果表14 所示：发酵之后屎肠球菌活性为2.61×109CFU/mL，发酵饲料可溶性糖含量12.37 mg/g，pH 为3.39，乳酸的含量为201.41 μg/mL，乙酸的含量为82.59 μg/mL，发酵饲料中未检测到丙酸和丁酸。符合最优发酵条件，既在此条件下发酵效果较好。

3 讨论

3.1 不同发酵因子对发酵玉米粉菌活性和pH的影响

研究表明在发酵过程中，接种量会影响发酵进程的快慢。陈智远等[18]报道发酵醋渣过程中加大接种量(秸秆厌氧发酵产气3 个月以上的活性污泥)能够快速启动厌氧发酵、减短发酵周期。本试验中菌种接种量增加，使发酵玉米中的屎肠球菌活性增加，进而缩短发酵所需时间。发酵过程中屎肠球菌菌株利用玉米中可溶性碳水化合物充分繁殖，迅速成为优势菌群，菌群数量扩大，杂菌繁殖受到抑制。随着发酵进行，发酵底物中的乳糖被屎肠球菌转化成葡萄糖和半乳糖，进而转变为乳酸等小分子化合物[19]，发酵玉米粉的pH 降低，发酵过程中相关酶产生受到抑制[20]，随着发酵底物的消耗，发酵过程中相关反应逐渐减慢直至停止。在本试验中，菌活性随着接种量的增大而增大，发酵玉米的pH 呈先上升后下降的趋势，pH 为4.03～4.17；发酵玉米粉中屎肠球菌活性呈逐渐上升的趋势。屎肠球菌F11.1G 在pH 4.0～7.0 时均可以正常增殖，虽然接种量对pH 有影响，但不影响屎肠球菌的正常增殖，虽然屎肠球菌活性呈逐渐上升的趋势，但差异均不显著，考虑发酵成本因素，选取5%、15%、25%三个接种量进行比较。

发酵过程中微生物以及其产生的酶对于发酵环境的氧气浓度非常敏感。发酵过程中料水比决定的是发酵过程中氧气浓度。在本试验中菌活性随着料水比的增加而增加，料水比≤1∶1 的3 组试验中菌活性呈上升趋势。屎肠球菌为兼性厌氧菌，氧浓度气过高会影响到菌体的繁殖；氧气浓度过低会导致发酵环境pH 降低[21]，影 响 其 活 性。在pH 为4.04 和pH 为3.60 时菌活均未达到最高，表明屎肠球菌的增殖已受到发酵环境pH 的影响。相关研究表明屎肠球菌在pH在4.0～7.5的环境中均可正常增殖，在过酸的条件下虽然有活性[22]，但活性受到影响，如徐树琴[23]研究发现藏羊源屎肠球菌在pH 为2.0 的培养16 h 后，菌活性为3.4×102CFU/mL，在pH 为3.0 培养4 h，菌活性为9.5×106CFU/mL。王晓蕊[24]试验结果表明，屎肠球菌在pH 为2.5 和3.0 的模拟胃液环境中存活率分别达44.10%和86.35%，在模拟肠液中的存活率达87.72%。袁钰等[25]研究发现豆汁源屎肠球菌DZ 在人工胃液（pH=3.0）中至少耐受3 h。综上屎肠球菌具有较强的耐酸性，在pH为4.0～7.5的环境中均可正常增殖。

发酵过程中屎肠球菌随着发酵时间的延长大量繁殖，会消耗玉米中的糖原物质，并将其转化成乳酸，导致发酵过程中饲料的pH逐渐降低，当发酵12 h时，菌活性为最低（0.31×109CFU/mL），发酵饲料pH 接近中性，推测玉米粉处于发酵初期。发酵时间在60～72 h时，发酵饲料的pH最低，菌活性下降，表明在60～72 h时发酵已接近尾声，此时屎肠球菌活性为3.28×109CFU/mL。说明发酵过程随着益生菌所需的养分逐渐枯竭，菌体有害代谢产物的累积，其毒性对菌体生长代谢产生反抑制作用[21]。

温度是发酵过程中影响菌活的因素之一，温度直接决定了益生菌的活性。在本试验中温度为25～40 ℃时菌活性均较高，说明此温度范围适宜屎肠球菌繁殖，温度在30～37 ℃时最适屎肠球菌的繁殖。Junfeng[26]从西藏牦牛（Bos grunniens）瘤胃中分离出的两株具有纤维素分解潜能的细菌，菌株被鉴定为屎肠球菌肠球（JF85）和屎肠球菌(Y83)分离物，分别在15～55 ℃时生长良好。综上，不同菌种最适繁殖温度不同，在制作发酵的过程中需要适宜发酵温度来促进发酵反应的进行。

3.2 不同发酵因子对正交试验结果的影响

3.2.1 不同发酵因子对可溶性糖的影响

随着发酵进行，屎肠球菌会大量繁殖，在此过程中会消耗玉米中的糖类物质（包括绝大部分单糖和寡糖转化成的葡萄糖和半乳糖）。任海伟等[27]试验结果表明，甜高粱青贮中WSC 含量随着发酵时间的延长逐渐降低，本试验结果与其一致。朱敏[28]试验结果表明，硫磺菌菌丝固态发酵燕麦，随发酵时间的延长总糖含量逐渐降低。在本试验中影响可溶性糖含量的因素中应选取相对较低水平。

3.2.2 不同发酵因子对pH的影响

pH 是衡量发酵饲料品质的重要指标。在本试验中发酵饲料的pH 为3.07～3.61。曹晶晶[29]研究表明乳酸菌甘薯淀粉浆液pH 从6.62 下降到3.67～3.88，其结果与本试验相符。韩翠萍等[30]报道植物乳杆菌发酵发酵玉米粉0～72 h，pH 从5.34 降至3.36，与本试验结果相似。发酵是一个产酸的过程，随着时间延长，饲料pH 呈逐渐下降的趋势。本试验中发酵玉米粉pH降低说明饲料中的屎肠球菌可利用玉米粉中的营养物质，并且产生酸性物质。较低的pH 能抑制饲料中有害微生物的活动从而更利于饲料的保存。在本试验中随着发酵的进行饲料pH 呈下降趋势，与上述试验结果相符合。

3.2.3 不同发酵因子对挥发性脂肪酸的影响

玉米粉发酵过程中玉米中的部分脂肪可被其发酵降解，增加挥发性脂肪酸含量。张伟彬[31]报道以复合酒曲（采用力克甜米酒曲、安琪甜酒曲、通风曲）发酵燕麦制作甜醅，随着发酵的甜醅中总酸含量增加。本试验中乳酸的含量最高，推测屎肠球菌属乳酸菌，会将玉米中的糖类物质转化成葡萄糖和半乳糖，然后转变成乳酸，随着发酵的进行乳酸含量呈现富集的现象。在本试验中随着发酵的进行饲料中有机酸的含量主要是乳酸和乙酸。史晓萌等[32]报道甜酒曲发酵燕麦产生的有机酸主要是乳酸和乙酸，与本试验结果相似。李斌等[33]报道在小麦、青稞和油菜黄贮时添加纤维素分解菌可以提高乙酸含量。饲料中丙酸、丁酸含量过高会影响饲料的适口性，从而影响动物的采食量。丁酸是经腐败菌等有害微生物分解蛋白质、葡萄糖和乳酸后所产生的代谢产物，其含量越低发酵饲料品质越好。丁亚伟等[34]报道复合益生菌（乳酸杆菌RSG-1、枯草芽孢杆菌B-1和地衣芽孢杆菌）发酵玉米-豆粕型饲料可降低丁酸含量。品质较好的发酵饲料中乳酸和乙酸含量应较高，丙酸和丁酸含量较低。本试验中丁酸虽有检出，但含量最低，符合发酵饲料品质要求。

4 结论

本试验获得屎肠球菌发酵玉米粉的最佳条件参数：接种量25%、料水比1∶1.4、发酵时间24 h、发酵温度30 ℃，在此下发酵条件下屎肠球菌发酵玉米粉的产酸效果较好。