DNA甲基化在紫外线相关皮肤病中的研究进展

陈雯婷, 钟欣妮, 李巍

苏州大学附属儿童医院,江苏 苏州 215025

DNA甲基化于1925年首次在细菌中被发现,此后的100年间,DNA甲基化蓬勃发展,研究逐渐发现其广泛存在于生物界,且大多在基因表达调控中具有重要抑制作用[1]。随着甲基化检测技术的发展,越来越多的差异甲基化位点被发现。研究表明,DNA甲基化与肿瘤、糖尿病、神经系统性疾病如阿尔茨海默症的发生息息相关[2]。皮肤是人体对抗外界环境的第一道防御屏障,许多皮肤病的发生与环境有关,如空气污染、吸烟、紫外线辐射等。其中紫外线辐射是参与DNA甲基化的重要一环,许多光源性皮肤病的发生均与其有关。本文对DNA甲基化在紫外线相关皮肤病中的研究进展进行综述,以期为光源性皮肤病的研究提供新思路。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是真核生物在染色体水平控制基因表达的重要机制,是指S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体,在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基(CH3-)转移到DNA双链胞嘧啶的第5个碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)[3]。在哺乳动物体内,DNA甲基化大多发生在二核苷酸残基上,而非甲基化CG常在基因组中成簇分布,这些长度约300～3 000 bp且CG含量高达60%的区域,就称为CpG岛(CpG islands,CGIs)。约60%人类基因启动子含有CpG岛,约6%的启动子在早期分化过程中发生甲基化。然而,CpG岛并不是发生DNA甲基化的唯一区域,其也可能发生在CpG岛岸即靠近CpG岛的低密度区域,常与转录失活有关。已有文献表明基因编码区的DNA甲基化能防止异常转录事件,以保证mRNA转录启动的保真性[4]。自1992年起亚硫酸氢盐测序技术逐步成为甲基化定量及定位的金标准[1],DNA甲基化研究进入了全基因组谱的时代,越来越多的疾病与DNA甲基化有关的假设被提出并证实,如肿瘤、神经系统疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病、心血管系统疾病等[5],在皮肤病领域,DNA甲基化也屡见不鲜。

2 DNA甲基化与紫外线相关皮肤病

2.1 皮肤光老化

皮肤老化由遗传因素和环境因素共同决定,遗传因素所致的老化称为时间老化或固有老化,而环境因素主要是紫外线辐射所致的老化,称为光老化,常集中于曝光部位。皮肤老化的外观常表现为皮肤松弛、皱纹、干燥、粗糙、毛细血管扩张等,此外,色素改变如黄褐斑、雀斑、炎症后色素沉着等亦与光老化密切相关,同时可伴有多种良恶性肿瘤的发生。

近年来,甲基化在光老化中的研究越来越深入。多个证据表明,受到紫外线暴露后,DNA甲基化整体是缺失的。有研究在UVA诱导人体成纤维细胞光老化实验中发现,UVA照射后的成纤维细胞与空白对照组相比,全基因组甲基化水平(A450值)显著降低,其差异有统计学意义(F=97.402,P<0.01)[6]。Vandiver等[7]通过全基因组亚硫酸氢盐测序,比较青年组(<35岁)和老年组(>60岁)防晒和暴露部位全层皮肤甲基化变化,发现在老年组暴露部位224个甲基化组块中,有185个组块存在甲基化缺失,缺失程度5%～23%不等,与青年组防晒部位相比,平均低9%,且低甲基化程度与光老化相关临床指标如Griffiths制定的光损伤临床分级高度相关,差异有统计学意义(R2=0.61,P<0.001)。

随着研究的深入,多个特异性甲基化指标逐步被证实,如单个CpG岛或部位甲基化位点的变化。多个体外实验表明,紫外线照射能够提高P16、RASSF1A等肿瘤抑制基因启动子甲基化,其转录受到抑制[8-9]。WNT1是在细胞凋亡通路中发挥重要作用的基因,研究发现,经UVB照射后,WNT启动子低甲基化,其mRNA及蛋白质表达呈UVB剂量依赖性增加,表明P16、RASSF1A、WNT1均是光老化生物学指标[10]。动物实验中亦有UV所致的甲基化变化,Yang等[11]用60 J/cm2的UVB每周2次,持续25周照射SKH-1无毛小鼠,构建光老化动物模型,发现在Slco5a1、Ogfrl1、Bend6、Mgat4a、Creg2等基因存在高甲基化,在Npbwr1、Plekhb2、Klf7、Mgat5、Ube2t、Phlda3等基因存在甲基化缺失。然而人体样本研究开展较少, 2015年巴西一项人体实验检测前臂内侧和外侧皮肤表皮和真皮,预测可能参与甲基化的MMP9、miR-137、KRT14及19均未见甲基化改变[12]。之后用相同方法检测miR-9-1、miR-9-3和MTHFR也未见甲基化改变[13]。

此外,有学者利用表观遗传时钟通过相关CpG岛减少的甲基化水平,可计算出给定样本生物学年龄的年龄预测模型。经典的Horvath表观遗传时钟[14]基于Illumina27K或Illumina450K芯片获得的7 844例非肿瘤样本的甲基化数据,对泛组织泛细胞的DNA甲基化水平进行评估,可以较准确地预测甲基化年龄。近年来针对成纤维细胞的表观遗传时钟逐渐被开发[15],可以灵敏而准确地跟踪离体成纤维细胞的动态老化,有助于体外老化模型的定量研究和开展光老化等衰老相关疾病的因果关系研究。

2.2 日光性皮炎

日光性皮炎又称日晒伤、晒斑,是指强烈日光(主要是UVB)照射后引起的皮肤急性炎症反应。Tilburg等[16]发现UVA照射48 h内,体外成纤维细胞454 543个CpG位点中,有248个差异甲基化,其中2/3甲基化丢失,且主要与IGFIR、FOXO1、RPTOR等细胞衰老基因有关。而UVA照射后1周,有162个位点差异甲基化,其中116个位点高甲基化,与PAX2、FOXG1、DELTA1、NOTCH4等参与细胞生长发育、防御的基因有关。表明皮肤受紫外线辐射后,DNA甲基化是持续波动的,在光损伤急性反应中,衰老相关基因低甲基化,可促进转录的表达。

2.3 光化性角化病

光化性角化病(actinic keratosis,AK)又名日光性角化病,主要是长期受紫外线辐射而引起的一种光线性皮肤病,被认为是皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)的癌前病变。有研究通过850K芯片技术比较正常、AK及cSCC人群皮损,发现AK和cSCC表现出相似的异常甲基化模式,且AK样本已表现出趋向cSCC样本的特征,即高甲基化的CpG岛及低甲基化的层相关结构域(lamina-associated domains,LADs),表明甲基化参与光化性角化病的发生,且从表观遗传层面上证实光化性角化病是皮肤鳞状细胞的癌前病变[17]。进一步研究分析关键转录因子相关调节阈中甲基化谱的区别,西班牙一项研究[18]表明AK/cSCC具有双源细胞起源模型,且表现出不同的临床特征,如表皮干细胞样起源的AK/cSCC具有更强的侵袭性和转移性,而角质形成细胞样起源的AK/cSCC预后则更好。用差异DNA甲基化谱鉴别细胞起源,将有助于对肿瘤患者进行风险评估,为进行下一步精准治疗提供依据。

2.4 皮肤肿瘤

2.4.1 皮肤鳞状细胞癌 皮肤组织起源于外胚叶及中胚叶,组织结构复杂,发生皮肤肿瘤的种类繁多,其中鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑色素瘤占国内皮肤恶性肿瘤的绝大多数[19-20]。cSCC又称表皮样癌,简称“鳞癌”,常发生于AK等癌前疾病的基础上,或由各种癌前期疾病演变而来,与紫外线辐射有明显相关性。

恶性肿瘤表观遗传学中的共性特征之一是抑癌基因或潜在的抑癌基因启动子高甲基化导致其表达沉默,促进肿瘤的发生,cSCC也不例外。AKAP12是AKAP蛋白激酶家族的一员,其功能是将蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和细胞周期素锚定在质膜上。在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中均被检测到AKAP12缺失,且其缺失被认为与启动子超甲基化有关。Wu等[21]发现,在sSCC样本中,AKAP12启动子区CpG岛也存在超甲基化,其mRNA及蛋白质低表达。对AKAP12更深入的研究发现,其表达与贝伐珠单抗等抗VRGF治疗相关肿瘤的敏感度呈负相关[22]。p16INK4a、p14ARF、CDH1、RB1、MGMT、RASSF1、ID4、FLIP1L等参与细胞周期调节、DNA修复、上皮细胞粘连与信号转导的基因启动子CpG岛甲基化也会产生转录沉默[23-25]。进一步明确上述基因与cSCC的关系,用甲基化抑制剂或去甲基化酶稳定表达,将有助于探索皮肤肿瘤的新型治疗靶点。

此外,其他相关基因启动子低甲基化也参与cSCC的发生。DSS1是参与DNA双链断裂错配修复的基因,当DNA双链断裂错配时,会导致染色体易位促进肿瘤的发生。Venza等[26]发现cSCC患者DSS1的启动子常低甲基化,DSS1常高表达,与sSCC的转移(P<0.001)、溃疡(P=0.003)、生存期低呈正相关,且DSS高表达的患者平均生存期11.07个月,而DSS低表达鳞癌患者为20.79个月。用5-Azacytidine(DNA甲基转移酶抑制剂)抑制启动子甲基化后,DSS1的mRNA及蛋白质表达显著增加(P<0.001),与cSCC预后不良存在显著关联。

2.4.2 基底细胞癌 基底细胞癌(basal cell carcinorna,BCC)又名基底细胞上皮瘤,是最常见的非黑素瘤性皮肤恶性肿瘤,约占皮肤恶性肿瘤的90%[27]。临床回顾性研究及Meta分析均证实紫外线辐射是诱导BCC发生的主要危险因素[28-29]。BCC分子生物学机制被认为主要与HH通路及相关基因、TP53、MYCN/FBXW7、Hippo-YAP、TERT等基因有关[30]。而编码Ras癌基因结合蛋白的RASSF1A也参与基底细胞癌的发生,过去在喉癌、食管鳞癌研究中较为广泛,近年来发现RASSF1A基因的高甲基化与UVB诱导的角质形成细胞恶性转化密切相关[31]。此外,Wnt信号通路在表皮干细胞生长、角质形成细胞增殖及皮肤的稳态与再生中发挥重要作用,NB-UVB抑制HaCaT细胞的增值及促进凋亡可能是通过下调Wnt信号通路实现的。张胜逆等[32]检测了62例BCC皮损组织标本,发现原癌基因Wnt1在BCC中的阳性率为87.10%,远高于在脂溢性角化中的阳性率25%,提示Wnt1参与BCC的发生。Lang等[33]进一步研究表明,表观遗传沉默引起Wnt的过表达,特别是Wnt1、2、5A、11、13及16均与BCC的发病机制有关。

2.4.3 恶性黑色素瘤 恶性黑素瘤来源于黑素细胞的恶性转化,被认为是最具侵袭性的皮肤肿瘤。其发病机制至今未明,紫外线通过氧化应激和遗传物质改变诱导皮肤趋癌环境形成是黑素瘤主要的病因之一。研究表明has-miR-300-GADD45B通过影响ROS清除和DNA损伤修复参与黑素瘤细胞的增殖、迁移和周期进展[34]。表观遗传调控致遗传物质改变也会影响黑素瘤细胞异常增殖。Roos等[35]通过322例健康白人女性脐周部皮肤活检,发现一系列备选基因在黑色素瘤和良性痣的启动子区存在差异甲基化,如位于基因体的TERT、CLPTM1L、TET2等,以及位于CpG岛岸的MC1R、PARP1、DOCK3等,这些基因常与细胞分化调控、上皮-间质转化、PI3K/mTOR信号转导通路等密切相关。研究发现癌症种系抗原(CGAs)通过DNA去甲基化在多种肿瘤中表达,在黑素瘤中,CGA表达增强与抗PD-1的敏感度相关,而与CTL4的敏感性无关[36],提示CGA的治疗性再激活可增强抗PD-1抑制剂的有效性,而不利于抗CTL4抑制剂的治疗。黑素瘤恶性程度高,易转移。有研究表明PD-1抑制剂免疫治疗在黑色素瘤患者体内效果欠佳且易耐药,通过去甲基化促进CGAs表达,有望增加PD-1治疗敏感度[36-37]。

DNA甲基化与皮肤恶性肿瘤密切相关。阿扎胞苷、地西他滨等作为DNA甲基转移酶-1(DNMT1)抑制剂已被广泛用于骨髓增生综合征等血液系统疾病的治疗,在皮肤恶性肿瘤治疗中尚属起步阶段,其疗效仍有待观察。靶向5-甲基胞嘧啶双加氧酶(TET)被认为是恶性肿瘤治疗的新突破。有数据表明,TET1与免疫检查点抑制剂(ICI)治疗更高的客观有效率、更好的持久临床获益、更长的无进展生存期和更好的总生存期有关[38]。此外,槐耳提取物可以通过调节CDKN2A和TP53的甲基化抑制cSCC细胞的增殖、迁移和侵袭[39]。这将推进皮肤恶性肿瘤的传统和表观遗传治疗结合的联合治疗策略。

2.5 红斑狼疮

红斑狼疮(lupus erythematosus,LE)归属于自身免疫性结缔组织病,其发病机制较为复杂,目前统一的观点是易感个体,在环境因素及性激素的作用下,产生异常免疫反应,紫外线辐射可以诱发LE,加重系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的皮损。成年红斑狼疮患者40%～90%存在光过敏现象[40]。光过敏也是美国风湿病学会提出的系统性红斑狼疮11条诊断标准之一[41]。

SLE是较为常见的临床类型,其特征是免疫细胞的失调,包括树突状细胞、B淋巴细胞、细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)、辅助性T细胞(CD4+T细胞)、调节性T细胞(Treg)等。其中,CD4+T细胞是SLE中研究最为广泛的细胞。Li等[42]用UVB照射SLE患者的CD4+T细胞后发现核蛋白Gadd4过表达,进而CD4+T细胞DNA甲基化水平降低,甲基化敏感基因如PRF1、TNFSF7等表达上调,导致T细胞的自身反应性增加,提示紫外线可能通过这一通路加重SLE病情。此外,紫外线加重SLE的作用机制也可能是通过调控CD4+T细胞甲基转移酶含量。有实验表明[43],UVB呈剂量依赖性SLE患者外周血CD4+T细胞DNMT酶催化活性,加重DNA低甲基化。

SLE患者CD8+T细胞中也存在表观遗传学调控。Miller等[44]发现与健康对照组相比,SLE患者CD8+T细胞存在188个低甲基化CpG位点,其中大部分位点与HLA-DRB1、STAT1有关,提示CD8+T细胞在狼疮中的致病机制可能存在表观遗传调控。调节性T细胞是介导多种自身免疫性疾病发生的重要细胞,SLE、炎症性肠病(inflammation bowel disease,IBD)等自身免疫性疾病中均可见Treg数量及功能受损。Cheng等[45]首次发现SLE患者Treg细胞中AHR的下调抑制了TET2的表达并上调了NT5E启动子的甲基化水平。

SLE患者B淋巴细胞甲基化的研究相对较少,相较于CD4+T细胞、粒细胞、单核细胞等,B细胞可能有更广泛的甲基化改变,并且以启动子高甲基化为主,如DDR1、TM4SF19、DLK1基因等,其中TNF是这些高甲基化基因的重要上游调节因子[46]。抗TNF治疗在炎风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、IBD等免疫性疾病中的运用已十分成熟,然而在SLE中尚存争议。TNF下游基因的B细胞高甲基化可能解释了系统性红斑狼疮中TNF失调的新机制。

此外,也有少数基因启动子低甲基化在SLE患者T、B淋巴细胞等不同细胞类型中共同存在,如IFI44L、PLSCR1等[46],部分学者甚至提出IFI44L启动子低甲基化可以作为诊断SLE生物标志物的建议[47],但仍有争议。差异甲基化位点作为诊断生物标志物的有效性有待被证实,与最常见的诊断性自身抗体之间的关系尚缺乏实质性证据,有待后续完善。

3 结语与展望

综上所述,DNA甲基化与紫外线辐射息息相关。DNA甲基化是一种复杂的多种酶促反应参与的转录调控机制,目前大量研究已证实紫外线刺激影响甲基化修饰,且照射时间长短与修饰程度有关,在日光性皮炎、光化性角化病、皮肤肿瘤、红斑狼疮等紫外线相关的皮肤疾病中存在众多靶点的甲基化,通过影响靶点表达,改变靶点功能,进而促进疾病的发生。但目前对DNA甲基化与光源性皮肤病发生的具体机制的认识仍不够,青少年春季疹、日光性荨麻疹等更多光源性皮肤疾病的甲基化靶点有待进一步总结归纳。甲基化是近年来皮肤病领域持久的研究热点,随着甲基化检测水平的提升,越来越多皮肤病中的差异甲基化位点被陆续发现,这使得甲基化药物的临床研究有广阔的前景。地西他滨(Decitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、泽不拉林(Zebularine)等甲基化抑制剂现已被广泛用于临床恶性肿瘤的治疗,新型的RSC133、DNMT3A-IN-1等DNA甲基转移酶抑制剂也已在逐渐运用。但甲基化抑制剂在皮肤恶性肿瘤中的运用尚不多见,在常见光老化等紫外线相关皮肤病中的应用尚有待开发研究。