N-酰基高丝氨酸内酯酶在肉鸡中应用的耐受性评价

陈 星 郑爱娟 陈志敏 张广民 王泽栋 刘国华 常文环 蔡辉益

(中国农业科学院饲料研究所,农业农村部动物产品质量安全饲料源性因子风险评估实验室,农业农村部饲料生物技术重点实验室,北京 100081)

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl hyperserine lactone,AHL)是负责介导革兰氏阴性菌群体感应(QS)的关键成员[1]。QS是细菌通讯的一个过程,调节生物膜的形成和其他毒力因子的产生,以便在宿主中建立致病机制[2]。抑制QS的过程称为群体感应淬灭(QQ),通过酶促降解来调节自身诱导物的积累[3]。QS过程依赖于小的可扩散信号分子的产生、释放和群体范围的检测,而这些信号分子通常是革兰氏阴性菌中的AHL[4]。研究发现,N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acyl-homoserine lactonase,AHLase)可以通过水解内酯键来降解AHL,抑制革兰氏阴性病原体的毒力因子分泌和生物膜形成等致病因素[5]。此外,与抗生素相比,QS抑制剂如AHLase不会使细菌因为选择压力而产生耐药性,这为其应用奠定了基础[6]。前期研究发现,500 mg/kg的AHLase显著改善了不同性别科宝肉仔鸡的生长性能、屠宰性能和养分表观代谢率,促进蛋白质和脂质在肉鸡体内的代谢和周转,并改善了肠道形态[7-8]。然而,关于高剂量AHLase对肉鸡生长发育的研究报道较少。因此,本试验依据《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》对AHLase进行耐受性评价,探究高剂量AHLase(5 000 mg/kg)对肉鸡生长性能、血液生理生化指标、器官指数和组织形态结构的影响,为AHLase在肉鸡上的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

AHLase外观性状为乳白色粉末,酶活性为104U/g。

1.2 试验设计

本试验采用双因素试验设计,选择健康且体重相近的1日龄科宝肉仔鸡360只作为研究对象,并将其随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只鸡,公鸡和母鸡各占1/2,并进行分笼饲养。在保证各组之间体重差异不显著(P>0.05)的情况下,科宝肉仔鸡的初始体重为(46.20±0.45) g。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加500和5 000 mg/kg的AHLase(有效成分活性分别为5×103和5×104U/kg)。基础饲粮配制参考NY/T 33—2004标准,其组成及营养水平与本课题组前期研究相同[7-8]。肉鸡每天的光照时长为16 h,黑暗时长为8 h。它们通过乳头式饮水器供水,并可以自由采食。饲养过程中使用水循环式暖气进行供热,初始鸡舍温度为33 ℃,之后每周逐渐降低2 ℃,最终稳定在24 ℃。鸡只在1日龄时接种马立克疫苗,并在7日龄时进行滴鼻点眼、接种新城疫和肾传支二联苗。试验期为42 d,期间肉鸡的饲养管理、免疫规程以及鸡舍的卫生管理都遵循科宝肉鸡饲养规程。

1.3 指标测定

1.3.1 生长性能指标[9]

在1、21和42日龄时,对肉鸡进行初重(BW)和末重(FW)的称量,并计算平均日增重(ADG)。同时,记录每日的喂料量、剩余料量和死亡数,以计算平均日采食量(ADFI)。根据ADG和ADFI的数据,计算料重比(F/G)。

1.3.2 血液生理生化指标

在42日龄时,每个重复随机选取2只鸡(公、母各1只),每组共计选取12只肉鸡。通过使用医用采血针从翅下静脉采集血液,将一部分储存在抗凝管中,以进行血液常规指标的测定;另一部分储存在促凝管中,放置于离心机中离心分离血清,用于血清生化指标的测定。使用细胞检测仪(TEK-Ⅱ mini全自动动物血液分析仪)检测白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞比容(HCT)、红细胞宽度变异系数(RDW-CV)、红细胞平均体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)以及平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。同时,使用全自动生化分析仪(日立7160,日本)测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的活性,以及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)和总胆红素(TBill)的含量。

1.3.3 器官指数

在42日龄时,每个重复随机取2只肉鸡(公、母各1只),每组共计选取12只肉鸡。经颈静脉放血致死后,取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胰腺、嗉囊、肌胃、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠和法氏囊,称重后计算器官指数,计算公式如下:

器官指数(g/kg)=器官重/活体重。

1.3.4 组织形态结构观察

在42日龄,每个重复选取体重接近的2只肉鸡(公、母各1只),颈静脉放血致死,分别取肉鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、肌胃、十二指肠、空肠、回肠和直肠,保存于4%多聚甲醛溶液中。将固定好的组织样品经脱水、透明、浸蜡、包埋后,用全自动旋转石蜡切片机(HM355S, Thermo Fisher Scientific Inc.,美国)进行切片,经自动染色机(A81500101, Thermo Scientifific,英国)染色后用中性树脂密封,光镜观察并拍照(400×)。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0软件进行AHLase添加水平和性别双因素方差分析,对主效应显著的指标进行Tukey’s多重比较。对AHLase添加水平和性别间交互效应显著的指标,公、母分别进行单因素方差分析,对主效应显著的指标进行Tukey’s多重比较。P<0.05为差异显著,0.05

2 结果与分析

2.1 AHLase对肉鸡生长性能的影响

2.1.1 AHLase对1～21日龄肉鸡生长性能的影响

AHLase对1～21日龄肉鸡生长性能的影响见表1。对于公鸡,与对照组相比,AHLase-5000组肉鸡平均日采食量显著提高(P<0.05),但与AHLase-500组之间无显著差异(P>0.05)。对照组、AHLase-500组和AHLase-5000组间在平均日增重和料重比无显著差异(P>0.05)。对于母鸡,饲粮中添加AHLase对肉鸡初重、末重、平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著影响(P>0.05)。

表1 饲粮中添加AHLase对1～21日龄肉鸡生长性能的影响

主效应分析表明,在性别方面,公鸡平均日增重和平均日采食量显著高于母鸡(P<0.05),而末重(P=0.079)和料重比(P=0.075)则有升高的趋势。在AHLase添加水平方面,随着AHLase添加水平的增加,AHLase-5000组的平均日采食量显著升高(P<0.05),平均日增重有升高的趋势(P=0.052),而料重比则显著降低(P<0.05)。肉鸡的性别和AHLase添加水平在平均日采食量中表现出显著互作效应(P<0.05)。

2.1.2 AHLase对22～42日龄肉鸡生长性能的影响

AHLase对22～42日龄肉鸡生长性能的影响见表2。对于公鸡,与对照组相比,AHLase-500组和AHLase-5000组肉鸡的料重比显著降低(P<0.05),但平均日增重和平均日采食量无显著变化(P>0.05)。对于母鸡,饲粮中添加AHLase对肉鸡平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著影响(P>0.05),但AHLase-5000组的末重显著高于对照组(P<0.05)。

表2 饲粮中添加N-酰基高丝氨酸内酯酶对22～42日龄肉鸡生长性能的影响

主效应分析表明,在性别方面,公鸡末重、平均日增重和平均日采食量显著高于母鸡(P<0.05),而料重比则无显著差异(P>0.05)。在AHLase添加水平方面,与对照组相比,AHLase-5000组的末重显著提高(P<0.05),AHLase-500组和AHLase-5000组的平均日采食和料重比显著降低(P<0.05),而平均日增重则无显著差异(P>0.05)。肉鸡的性别和AHLase添加水平在平均日采食量中表现出显著互作效应(P<0.05),而在料重比中表现出互作趋势(P=0.069)。

2.1.3 AHLase对1～42日龄肉鸡生长性能的影响

AHLase对1～42日龄肉鸡生长性能的影响见表3。对于公鸡,与对照组相比,AHLase-5000组料重比显著降低(P<0.05),而平均日增重和平均日采食量无显著差异(P>0.05)。对于母鸡,对照组、AHLase-500组和AHLase-5000组平均日增重无显著差异(P>0.05)。饲粮中添加AHLase显著降低母鸡的平均日采食量(P<0.05),但AHLase-500组和AHLase-5000组之间无显著差异(P>0.05)。

表3 饲粮中添加AHLase对1～42日龄肉鸡生长性能的影响

主效应分析表明,在性别方面,公鸡平均日增重和平均日采食量均高于母鸡(P<0.05),而料重比显著降低(P<0.05)。在AHLase添加水平方面,AHLase-500组和AHLase-5000组的料重比显著降低(P<0.05),平均日采食量有降低的趋势(P=0.065),而平均日增重则无显著差异(P>0.05)。肉鸡的性别和AHLase添加水平在料重比中表现出显著互作效应(P<0.05),而在平均日增重中表现出互作趋势(P=0.064)。

2.2 AHLase对42日龄肉鸡血常规指标的影响

AHLase对42日龄肉鸡血常规指标的影响见表4。与对照组相比,AHLase-500组和AHLase-5000组肉鸡白细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞计数、红细胞比积、红细胞宽度变异系数、红细胞平均体积、平均红细胞血红蛋白含量以及平均红细胞血红蛋白浓度均无显著影响(P>0.05)。

表4 饲粮中添加AHLase对42日龄肉鸡血常规指标的影响

2.3 AHLase对42日龄肉鸡血清生化指标的影响

AHLase对42日龄肉鸡血清生化指标的影响见表5。饲粮中添加500和5 000 mg/kg的AHLase对肉鸡血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性及葡萄糖、总蛋白、白蛋白、尿素、肌酐和总胆红素含量均无显著影响(P>0.05)。

表5 饲粮中添加AHLase对42日龄肉鸡血清生化指标的影响

2.4 AHLase对42日龄肉鸡器官指数的影响

AHLase对42日龄肉鸡器官指数的影响见表6。饲粮中添加AHLase对42日龄肉鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、胰腺、脾脏、胸腺和法氏囊指数均无显著影响(P>0.05)。

表6 饲粮中添加AHLase对42日龄肉鸡器官指数的影响

主效应分析表明,在性别方面,与母鸡相比,公鸡直肠指数有降低的趋势(P=0.088),脾脏指数有升高的趋势(P=0.079)。在AHLase添加水平方面,相比于对照组和AHLase-5000组,AHLase-500组空肠指数有升高的趋势(P=0.059)。肉鸡的性别和AHLase添加水平在心脏指数中表现出互作趋势(P=0.089)。

2.5 AHLase对42日龄肉鸡组织形态结构的影响

AHLase对42日龄肉鸡组织形态结构的影响见图1。AHLase-500组和AHLase-5000组肉鸡心脏中心肌纤维结构清晰,排列紧密,肌纤维间未见炎性细胞浸润及水肿。肺脏结构清楚,肺泡间隔、肺泡腔及小支气管均未见明显异常。肝脏中肝细胞呈多边形,细胞核清晰;肝细胞呈辐射状排列在中央静脉的周围;中央静脉可见少量血液,窦状隙未见扩张。脾脏中脾脏红、白髓相间分布;脾窦狭窄,脾窦内有大量血细胞、脾小体轮廓清晰、大小不等、脾脏组织整体结构正常。肾脏组织皮质小叶和髓质小叶结构清晰,皮质小叶中肾小体分布在中央静脉周围,肾间质可见少量淤血,肾小球和肾小管结构正常。胰腺腺泡轮廓清晰,胰岛大小不等,散在分布,胰腺整体结构较正常。十二指肠、空肠、回肠和直肠绒毛长而直且黏膜上皮完整,杯状细胞夹杂在肠柱状上皮细胞之间,固有层中可见大量肠腺,结构完整清晰,整体结构正常。

图1 饲粮中添加AHLase对42日龄肉鸡组织形态结构的影响

3 讨 论

3.1 AHLase对肉鸡生长性能的影响

前期研究中发现,饲粮补充AHLase显著提高试验期肉鸡的平均日采食量和料重比,而对平均日增重则无显著影响[7]。本试验基于前期研究的适宜添加水平,依据《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》对AHLase进行了耐受性评价试验。在本研究中,AHLase-500组和AHLase-5000组肉鸡的平均日增重、平均日采食量和料重比之间均无显著差异,这表明科宝肉鸡可以耐受5 000 mg/kg的AHLase添加水平且不会造成负面影响。与对照组相比,AHLase-5000组肉鸡的平均日采食量和料重比降低。这个结果可能阐释了饲粮中添加5 000 mg/kg的AHLase依旧可以发挥淬灭AHL介导的病原菌之间群体感应机制的能力,通过内酯键的酶促水解降解AHL的功效[10]。此外,AHLase也可通过促进宿主抗感染和抗炎因子的表达,提高肉鸡抵抗病原菌侵染的能力,这也可能是生产性能改善的原因之一[11]。同时,观察到公鸡的平均日增重和平均日采食量均显著高于母鸡。与母鸡相比,公鸡对于营养物质的吸收能力较强,可以将更多的营养物质储存在机体中,进而提高肉鸡的平均日增重[12-13]。

3.2 AHLase对肉鸡血常规指标的影响

血常规是判断家禽机体健康的重要指标之一[14]。白细胞是体内重要的免疫细胞,通过分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等参与机体炎症和免疫调节[15]。红细胞的变化则往往代表着机体内环境的失衡,而血小板和血小板压积通常与机体健康密不可分[16]。在本试验中,与对照组相比,AHLase-500组和AHLase-5000组肉鸡的血常规指标均无显著差异,表明饲粮中添加5 000 mg/kg的AHLase并未引发肉鸡相关的血液和免疫等生理方面的疾病。

3.3 AHLase对肉鸡血清生化指标的影响

血清中的蛋白质在动物的生理和病理活动中扮演着重要角色[17]。总蛋白含量可以反映生物体的营养状况,而白蛋白和球蛋白在调节免疫系统中起关键作用[18]。尿素作为动物蛋白质分解代谢的最终产物,通过肝脏中的鸟氨酸循环合成,并随后在肾脏中排泄[19]。此外,谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶的活性对于评估肝脏毒性非常重要,任何病理表现或毒性都可能导致谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的增加[20]。同时,谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性也可以作为衡量肝脏损伤程度的特定指标[21]。饲粮中添加500和5 000 mg/kg的AHLase对肉鸡血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性及葡萄糖、总蛋白、白蛋白、尿素、肌酐和总胆红素含量无显著影响,表明添加5 000 mg/kg的AHLase并未造成肉鸡机体生化代谢异常。

3.4 AHLase对肉鸡器官指数以及组织形态结构的影响

器官指数,即器官的相对重量,是衡量家禽细菌感染和免疫功能状况的重要指标[22]。免疫器官的发育与免疫功能密切相关,在一定程度上来说,器官指数越高,则免疫功能越强[23]。胸腺和法氏囊作为中枢免疫器官,是淋巴细胞发育、分化和成熟的主要场所。脾脏是主要的外周淋巴器官,它与肝脏一起包含大量的免疫细胞,因此是细胞和体液免疫反应的重要场所[24]。在本试验中,饲粮中添加500和5 000 mg/kg的AHLase对肉鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、胰腺、脾脏、胸腺和法氏囊指数均无显著影响。此外,本试验还对心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、肌胃、十二指肠、空肠、回肠和直肠进行了组织形态结构观察,结果显示饲喂500和5 000 mg/kg的AHLase的肉鸡组织无病理变化,表明5 000 mg/kg AHLase的添加水平并不会引发组织病变。

4 结 论

本试验未发现饲粮中添加5 000 mg/kg的AHLase对肉鸡生长性能、血液生理生化指标、器官指数以及组织形态结构造成显著影响。综上所述,5 000 mg/kg AHLase在肉鸡饲粮中的添加水平是安全的。