乳酸菌素对肉鸡生长性能、血清指标和肠道健康的影响

王丽君 徐静雅 赖欣宇 岳闫蕊 马 慧 崔梦鸽 冯 嘉 姜艳芬 闵育娜*

(1.西北农林科技大学动物科技学院,杨凌 712100;2.西安若翰生物饲料有限公司,西安 710300;3.西北农林科技大学动物医学院,杨凌 712100)

随着抗生素药物残留和耐药性等问题在动物生产中日益凸显,在无抗、减抗饲养背景下,开发用于家禽业的绿色、安全和无残留抗生素替代品已成为研究热点。细菌素是细菌核糖体合成的小分子抗菌肽,能够损伤细菌细胞膜和细胞壁[1],抑制革兰氏阴性菌和阳性菌活性,被认为是安全和毒副作用小的抗菌肽[2],具有“替抗”潜力[3]。乳酸菌素是乳酸菌代谢过程中合成和分泌的一类抑制革兰氏阳性菌(尤其是亲缘性较近的细菌)生长的杀菌蛋白或多肽[4]。乳酸菌素能抑制肠道产气荚膜梭菌,降低有害菌丰度,调节肠道菌群结构从而利于肉鸡肠道健康和生长性能[5-6]。Kierończyk等[7]研究发现,肉鸡饲粮中添加乳酸菌素能提高饲料转化率,且抗菌作用方式与莫能菌素相似,在肉鸡肠道微生物群的正向调节中发挥重要作用。羊秀美等[8]研究发现,饲粮中添加乳酸菌素可显著改善肉鸡抗氧化性能以及肠道组织形态。目前,关于乳酸菌素在爱拔益加(AA)白羽肉鸡饲粮中的应用以及乳酸菌素对其生长性能、血清生化指标、血清抗氧化指标和肠道健康的影响的综合分析的报道较少。因此,本研究旨在探究乳酸菌素对肉鸡生长性能、血清生化指标、血清抗氧化指标、肠道形态和盲肠微生物的影响,为其在肉鸡无抗养殖中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用乳酸菌素是一种多肽(98%),为淡黄色粉末,活性为0.8×106IU/g,由大枣、豆粕、玉米粉、麦麸、葡萄糖通过嗜酸乳杆菌和酿酒酵母菌深度发酵而成(产品中乳酸菌已灭活)。

1.2 主要试剂以及仪器

主要试剂:0.9% NaCl溶液、4%多聚甲醛溶液、苏木精-伊红染液、琼脂糖、超纯水、75%酒精。

主要仪器:电子体重秤、手术器械(无齿镊、尖刃手术刀、组织剪、眼科剪)、Agilent 2100生物分析仪、Illumina文库定量试剂盒。

1.3 试验动物及试验设计

试验选取健康且体重相近的1日龄白羽肉仔鸡270只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加1%、2%乳酸菌素。基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,分为1～21日龄阶段饲粮、22～42日龄阶段饲粮,均根据《爱拔益加商品代肉鸡营养标准》推荐营养需要量配制,其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.4 化学分析

饲粮干物质含量参照GB/T 6435—2014,使用DGX-9243B-2电热恒温鼓风干燥箱进行测定;粗蛋白质含量参照GB/T 6432—2018,使用KDY-9820凯氏定氮仪测定; 赖氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量参照GB/T 18246—2019的常规酸水解法和氧化酸水解法,使用L-89001001A氨基酸自动分析仪测定;钙含量参照GB/T 13885—2017,利用原子吸收光谱法使用AA300型原子吸收分光光度计测定;饲料磷含量参照GB/T 6437—2018,使用岛津UV-2550紫外可见分光光度计测定。

1.5 饲养管理

试验鸡自由采食,自由饮水。每日08:30和14:30分别记录鸡舍温度和湿度,试验开始前3天保持雏鸡生长温度34 ℃,之后每周降温2 ℃,直到平均温度维持在(24±2) ℃,相对湿度保持在60%～70%。及时打扫,保证鸡舍环境整洁,试验过程中按常规的操作程序进行疫苗接种防疫,记录防疫情况;试验场地和鸡舍清洁卫生,并进行正常消毒;试验鸡舍通风良好,并保持温度稳定;饲料生产按标准进行,保证试验鸡生长环境良好,降低对试验的干扰。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 生长性能

每周以重复为单位称料重,以重复为单位计算1～21日龄、22～42日龄、1～42日龄的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

ADG=(末重-初重)/(试验鸡数×试验天数);ADFI=总采食量/(试验鸡数×试验天数);F/G=ADFI/ADG。

1.6.2 血清生化、抗氧化指标

在21和42日龄,每组选取6只鸡(每个重复选取1只鸡)进行翼下静脉采血3 mL,用采血软管采集血液后45 °斜置,待血清析出后使用Eppendorf Centrifuge 5425离心机3 000 r/min离心10 min,收集血清于1.5 mL离心管中,标记好后于-20 ℃保存待测。血清生化指标分别按照试剂盒说明使用BCA微板法测定总蛋白含量,使用微量酶标法测定白蛋白含量和碱性磷酸酶活性,使用脲酶法测定尿素氮含量,使用酶比色法测定尿酸含量,使用ABTS自由基清除法测定总抗氧化力,使用5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法测谷胱甘肽过氧化物酶活性,使用羟胺法测定总超氧化物歧化酶活性,使用TBA硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量。试剂盒购自南京建成生物工程研究所,测定方法严格按照试剂盒说明书执行。

1.6.3 肠道组织形态

在21和42日龄,每个重复选取1只接近平均体重肉鸡进行屠宰,将鸡处死后打开腹腔,迅速分离并取出肠段(十二指肠、空肠、回肠),分别剪取中1/3段的肠道组织2 cm左右,去除附着物并用生理盐水冲洗干净后,置于4%多聚甲醛溶液中固定。将固定好的肠道样品经修块、脱水、透明、浸蜡、包埋等处理后,切成约6 μm厚的切片,苏木精-伊红(HE)染色。采用Nicon NIS-Elements图像分析系统,测定肠道绒毛高度和隐窝深度,并计算绒毛高度/隐窝深度(VCR)。

1.6.4 肠道微生物菌群组成

取5～8 cm十二指肠、空肠和回肠中1/3段,纵向剖开,使用载玻片刮取黏膜,迅速装入冻存管,置于液氮中速冻后,存放于-80 ℃待测;分离盲肠,收集盲肠内容物置于冻存管中,使用液氮速冻后,存放于-80 ℃待测。

取0.3 g肠道内容物,选择十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取总DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量,同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。以获得的DNA为模板,使用引物5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’(341F)和5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’(805R)对微生物16S rRNA基因的V3～V4可变区域进行PCR扩增。扩增条件为:95 ℃预变性2 min,随后进行35个循环反应(98 ℃下,变性40 s;54 ℃,退火30 s;72 ℃,延伸45 s),最后,72 ℃,延伸10 min。PCR扩增产物使用2%琼脂糖凝胶进行检测,并用AMPure XT beads回收试剂盒进行回收、纯化。随后对纯化的产物进行定量、混合。最后使用NovaSeq 6000测序系统进行2×250 bp的双端测序。

1.7 数据分析

试验数据用Excel2019进行统计整理,用SAS 9.4统计软件的ANOVA程序进行单因素方差分析,以Duncan氏法进行多重比较,最终结果用“平均值±标准差”表示。P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示有提高或降低的趋势。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌素对肉鸡生长性能的影响

由表2可知,与对照组相比,乳酸菌素对肉鸡生长性能无显著影响(P>0.05)。

表2 乳酸菌素对肉鸡生长性能的影响

2.2 乳酸菌素对肉鸡血清生化指标的影响

由表3可知,与对照组相比,添加1%乳酸菌素极显著降低21日龄肉鸡血清中尿素氮含量(P<0.01)以及42日龄血清尿酸含量(P<0.01),添加2%乳酸菌极显著降低21和42日龄肉鸡血清尿酸含量(P<0.01)。

表3 乳酸菌素对肉鸡血清生化指标的影响

2.3 乳酸菌素对肉鸡血清抗氧化指标的影响

由表4可知,与对照组相比,饲粮中添加2%乳酸菌素可显著或极显著提高21(P<0.05)和42日龄(P<0.01)肉鸡血清总抗氧化能力,显著降低了42日龄肉鸡血清丙二醛含量(P<0.05)。各组间的血清谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧化物歧化酶活性的差异不显著(P>0.05)。

表4 乳酸菌素对肉鸡血清抗氧化指标的影响

2.4 乳酸菌素对肉鸡肠道形态的影响

由表5可知,与对照组相比,饲粮中添加2%乳酸菌素极显著提高21日龄肉鸡十二指肠绒毛高度以及绒毛高度/隐窝深度(P<0.01),极显著降低十二指肠和回肠隐窝深度(P<0.01);饲粮中添加1%乳酸菌素极显著降低21日龄肉鸡回肠隐窝深度(P<0.01),显著提高回肠绒毛高度/隐窝深度(P<0.05)。

表5 乳酸菌素对21日龄肉鸡肠道形态的影响

由表6可知,与对照组相比,饲粮中添加乳酸菌素(1%和2%)可极显著降低42日龄肉鸡十二指肠隐窝深度(P<0.01),极显著提高十二指肠绒毛高度/隐窝深度(P<0.01)。

表6 乳酸菌素对42日龄肉鸡肠道形态的影响

2.5 乳酸菌素对肉鸡肠道微生物的影响

2.5.1 肉鸡盲肠微生物的扩增子序列变异(ASV)数目比较分析

上机测序完成后,将原始数据RawData中的双端数据进行拼接,并进行质控、嵌合体过滤,获得CleanData。DADA2(Divisive Amplicon Denoising Algorithm)通过“去重复”等步骤,获得单碱基精度的代表序列,然后使用ASV构建类操作分类单元(OTU)表,获得ASV特征表以及特征序列。

由图1可得,共得到6 840个ASV,对照组有3 268个ASV,1%乳酸菌素组有2 709个ASV,2%乳酸菌素组有2 629个ASV。

图1 盲肠微生物的ASV数目

2.5.2 Alpha多样性分析

乳酸菌素对肉鸡盲肠微生物Alpha多样性的影响见表7,各组Goods _coverage指数均为1.00,反映了本次测序结果可准确代表肉鸡盲肠微生物的菌群情况。

表7 乳酸菌素对肉鸡盲肠微生物Alpha多样性指数的影响

对21日龄肉鸡盲肠微生物Alpha多样性指数进行分析可得:2%乳酸菌素组Observed_OTUs指数显著高于1%乳酸菌素组及对照组(P<0.05),2%乳酸菌素组Chao1指数高于1%乳酸菌素组及对照组(0.05≤P<0.10);对42日龄肉鸡盲肠微生物Alpha多样性指数进行分析可得:各组间各指数无显著差异(P>0.05)。

2.5.3 Beta多样性分析

由图2-A可知,21日龄肉鸡Beta多样性第1主成分的贡献率为14.57%,第2主成分的贡献率为11.90%,对照组和1%乳酸菌素组、2%乳酸菌素组间的样本分散较远,群落结构相似性可能有较大差异。

图2 乳酸菌素对21(A)和42日龄(B)肉鸡盲肠微生物Beta多样性的影响

由图2-B可知,42日龄肉鸡Beta多样性第1主成分的贡献率为21.27%,第2主成分的贡献率为13.70%,对照组和1%乳酸菌素组间的样本分散较远,群落结构相似性可能有较大差异,对照组和2%乳酸菌素组间的样本分散较近,群落结构相似性差异较小。

2.5.4 菌群组成分析

在分类学水平上,肉鸡盲肠中共检测到41个门和678个属。从41个门中选择相对丰度排名前10的物种,生成门水平物种相对丰度柱形图。由图3-A可知,21日龄肉鸡盲肠中,各组相对丰度均大于1%的物种为厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota);42日龄肉鸡盲肠中,各组相对丰度均大于1%的物种为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门(Proteobacteria)。从679个属中选择相对丰度排名前30的物种,生成属水平物种相对丰度柱形图。由图3-B可知,21日龄肉鸡盲肠中,各组相对丰度均大于1%的物种为未分类梭状芽孢杆菌_UCG-014(Clostridia_UCG-014_unclassified)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、未分类梭状芽孢杆菌vadinBB60群(Clostridia_vadinBB60_group_unclassified)、未分类毛螺菌科(Lachnospiraceae_unclassified)、另枝菌属(Alistipes)、未分类瘤胃球菌科(Ruminococcaceae_unclassified)和分枝杆菌属(Negativibacillus)。由表8可知,与对照组相比,在饲粮中添加2%乳酸菌素可显著降低21日龄肉鸡盲肠中粪杆菌属相对丰度(P<0.05),极显著增加UCG-005的相对丰度(P<0.01)。

图3 乳酸菌素对肉鸡盲肠微生物门水平(A)和属水平(B)相对丰度的影响

表8 乳酸菌素对肉鸡盲肠微生物属水平相对丰度的影响

由图3-B可知,42日龄肉鸡盲肠中,各组相对丰度均大于1%的物种为未分类梭状芽孢杆菌_UCG-014、粪杆菌属、未分类梭状芽孢杆菌vadinBB60群、未分类毛螺菌科、另枝菌属、未分类瘤胃球菌科、分枝杆菌属、拟杆菌属(Bacteroides)和未分类厚壁菌门(Firmicutes_unclassified)。由表8可知,与其他组相比,在饲粮中添加1%乳酸菌素可极显著增加真杆菌属产粪甾醇真杆菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)的相对丰度(P<0.01)。

3 讨 论

3.1 乳酸菌素对肉鸡生长性能的影响

肉鸡的生长性能与肠道健康密切相关,研究表明,细菌素可以通过增强肠道健康改善动物生长性能[9]。乳酸菌素是乳酸杆菌、乳酸球菌、链球菌等的代谢物,是乳酸菌在肠道发挥益生特性的关键成分之一[10],能够改善畜禽生产性能。林滉等[11]、Kierończyk等[12]在肉鸡饲粮中添加乳酸菌素改善了肉鸡平均日增重和料重比。然而,本研究结果显示,乳酸菌素对肉鸡的生长性能无显著影响。Fajardo等[13]在肉鸡饲粮中添加乳酸菌及其细菌素发现肉鸡生长性能并未改善。Such等[14]研究发现,饲粮中添加乳酸杆菌和丁酸梭菌并不会造成肉鸡体重、采食量和饲料转化率差异。这可能是由于白羽肉鸡生长速度快、饲养周期短,且乳酸菌素进入机体主要作用靶点在肠道发挥免疫调节作用,因此对照组与试验组肉鸡生长性能的差异相对不显著,应激或病理条件下乳酸菌素可能产生更好效果[15],其对生长性能的影响仍有待进一步研究。

3.2 乳酸菌素对肉鸡血清生化指标的影响

血清生化指标能够反映动物机体的物质代谢能力和相关生理机能[16]。其中,血清总蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成,是反映机体肝脏合成功能的重要指标[17]。血清尿素氮是家禽蛋白质代谢的终产物,其含量能够反映肉鸡蛋白质和氨基酸之间的平衡,是衡量机体蛋白质沉积的重要指标之一,其含量越低,表明氨基酸平衡越好,机体蛋白质合成率较高[18]。尿酸是禽类嘌呤代谢的终末产物,血清尿酸含量升高会引发痛风。总蛋白、尿素氮以及尿酸的含量能够反映机体对蛋白质的吸收状况。管乐琪等[19]、黄胜男等[20]研究表明,饲粮中添加乳酸菌能够降低肉鸡血清尿素氮及尿酸含量。本研究中,与对照组相比,添加1%乳酸菌素能够极显著降低21日龄肉鸡血清尿素氮含量,添加2%乳酸菌素能够极显著降低21和42日龄肉鸡血清尿酸含量。与前人研究结果相似,说明在饲粮中添加乳酸菌素不影响肉鸡的肝脏健康,可促进机体蛋白质代谢,有利于机体氨基酸平衡及肉鸡健康。

3.3 乳酸菌素对肉鸡血清抗氧化指标的影响

肉鸡在正常代谢过程中会不断地产生自由基,其产生与消除失衡会引起氧化应激,造成动物体内不可修复的氧化损伤,进而影响整个机体的功能[21],为了在进化过程中处理各种类型的自由基和氧化应激,机体形成天然的抗氧化系统以保护机体免受氧化应激[22]。血清抗氧化指标能够反映机体抗氧化系统的水平,其中,总抗氧化力是抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平,是衡量机体抗氧化能力的综合指标。丙二醛是自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物,可以反映机体脂质过氧化速率和强度,也能间接反映组织过氧化损伤程度,其含量越高表明脂质受到氧自由基攻击的程度就越高[23]。本研究发现,饲粮中添加乳酸菌素能够提高21和42日龄肉鸡总抗氧化力,显著降低丙二醛含量,与Xu等[24]、Cao等[25]研究结果一致,说明饲粮补充乳酸菌素有利于增强肉鸡抗氧化性能。但乳酸菌素对抗氧化酶活性无显著影响,这可能是由于在抗氧化体系中乳酸菌素对抗氧化酶系统和非酶抗氧化系统的影响存在差异,有待进一步研究。

3.4 乳酸菌素对肉鸡肠道形态的影响

家禽小肠上皮结构是影响营养物质消化吸收的关键因素[26]。已被证明一些消化过程和所有吸收过程发生在肠绒毛和隐窝内或周围,绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度是判断小肠吸收能力的关键参数[27],绒毛高度/隐窝深度增大,肠道消化吸收能力提高。已有的研究表明,在饲粮中添加益生菌能够通过改善肠黏膜的组织形态进而促进其营养的代谢利用[28]。本试验结果显示乳酸菌素可对肉鸡肠道形态产生积极效果,可显著提高21和42日龄肉鸡肠道绒毛高度/隐窝深度,这与Cole等[29]、程鹏等[30]试验结果一致。De Giani等[31]研究发现,乳酸菌素能通过表皮生长因子(EGFR)作用于肠道上皮细胞,从而增强了健康细胞的增殖活力,因此提高了小肠绒毛高度/隐窝深度。这证实了本试验所用乳酸菌素能够在肠道发挥益生功能,改善肠道物理屏障。

3.5 乳酸菌素对肉鸡肠道微生物的影响

肠道微生物及其代谢产物(细菌素、有机酸、维生素等)参与宿主肠道组织免疫调节,乳酸菌属是肠道益生菌的核心组[32]。本试验结果表明,添加乳酸菌素能够在属水平上显著降低21日龄肉鸡盲肠中粪杆菌属和未分类毛螺菌科相对丰度,显著增加UCG-005的相对丰度,1%乳酸菌素可显著增加42日龄肉鸡盲肠真杆菌属产粪甾醇真杆菌群的相对丰度。这4类菌属与胃肠道中丁酸盐的浓度密切相关[32-35],其丰度结果不一致原因可能与微生物之间互作有关,研究表明,肠道共生菌产生的细菌素在肠道中可通过抵御敏感菌来调节菌群的竞争性动态变化[36]。因此,饲粮中添加乳酸菌素引起肠道UCG-005的相对丰度增高,造成丁酸盐产生旺盛,因此可能抑制了粪杆菌属与毛螺菌科未分类属的生长。

乳酸菌素作为乳酸菌益生特性的介导者,能够增加有益菌的丰度促进丁酸盐和短链脂肪酸的产生,这与O’Reilly等[37]、Xu等[38]研究结果一致。研究发现,丁酸盐能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性和促进肌动蛋白结合蛋白突触蛋白(SYNPO)的表达来改善肠道屏障完整性并加速细胞运动[39]。这一结果与肠道绒毛高度/隐窝深度所反映的结果相一致,乳酸菌素可能通过增加产丁酸盐丰富的菌群丰度来改善肠道屏障的机制。进一步证明乳酸菌素通过调节肠道微生物菌群平衡及其代谢物,从而有利于维持肉鸡肠道健康。可能是由于AA肉鸡生长快、饲养周期短,乳酸菌素进入机体主要在肠道发挥其效益从而有助于机体健康,其对生长性能的影响有待进一步研究。

4 结 论

饲粮中添加乳酸菌素可提高肉鸡血清总抗氧化力,调节肉鸡盲肠微生物菌群结构,尤其是提高了产丁酸盐的菌属相对丰度,如UCG-005和真杆菌属产粪甾醇真杆菌群,提高小肠绒毛高度/隐窝深度,有利于肉鸡对饲粮蛋白质的利用,进而维持机体健康。