大麻素2型受体在加速正畸牙移动中的作用

范登莹,翟浩嫣,刘慧娟,赵 圆,李东娜,乔 星,康文静,朱德超,刘春艳

亚洲人错合畸形发病率高达48%[1],目前临床上正畸疗程长达2年。随着生活节奏加快,越来越多的患者要求缩短正畸治疗疗程。因此,加速正畸牙齿移动(orthodontic tooth movement, OTM)逐渐成为学者们关注的热点。临床上主要通过手术加速OTM,但适应证严格,存在不确定性、风险高等缺点。因此有必要研究调控破骨进程的有效靶点,加速正畸速率,缩短矫治疗程。牙齿移动速度取决于破骨细胞数量和牙槽骨吸收活性。目前研究[2]表明大麻素2型受体(cannabinoid receptor 2, CB2)可能通过负调控破骨细胞在牙槽骨吸收过程中发挥作用。CB2主要分布于外周与免疫细胞,与骨代谢有关。研究[3]证明当CB2缺乏时,破骨细胞数量增加和功能增强, CB2基因敲除的中年小鼠牙槽骨密度显著下降[4]。然而CB2在OTM过程中的影响尚不清楚,因此,该研究拟通过建立CB2-/-小鼠OTM模型,观察CB2在正畸过程中对OTM速率和压力区牙槽骨吸收的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级CB2-/-小鼠购自北京集萃药康生物科技有限公司。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建C57BL/6J 品系 CB2基因敲除小鼠,与C57BL/6品系WT小鼠交配,获得子代杂合子,然后使用子代杂合子互配获取足量纯合子和同窝野生小鼠用作实验鼠。所有小鼠都饲养在无病原体条件下。SPF房温度设定为(23±3)℃,保持相对湿度(60±5)%,维持标准的 12 h明暗循环。动物实验方案通过河北医科大学科研伦理审查委员会批准(批准号：20220301)。每鼠笼CB2+/-雄鼠与CB2+/-雌鼠以1 ∶2配繁,仔鼠出生3周到4周期间进行断奶、基因型鉴定和分笼。

1.1.2主要试剂及仪器 基因组 DNA 提取试剂盒(DP304,天根,北京),TAE(ZS205-3,庄盟,北京),琼脂糖(1613102EDU,伯乐,美国),核酸染料(ZS-M18006,中实同创,天津),DL2000 DNA Ladder(M0046,LifeSct LLC,美国),SYBR Green PCR 预混液(ZS-M13002,庄盟,北京),DNA上样缓冲液(D0071,碧云天,上海),流动性光固化树脂(3M ESPE,美国),酸蚀剂(3M ESPE,美国),4% 多聚甲醛(P0099,碧云天,上海),苏木精-伊红染色液(BA4025,贝索,珠海),抗酒石酸盐酸性磷酸酶试剂盒(CR2107063,塞维尔生物,武汉),抗基质金属蛋白酶-9抗体(ARG40613,Arigobio,上海),Tween 20(ZLI-9309,中杉金桥,北京),兔二步法试剂盒(PV-6001,中杉金桥,北京),戊巴比妥钠(Merck,美国),伯乐梯度PCR仪(T100 Thermal Cycle,伯乐,美国),三恒多用电泳仪(DYY-6D,北京六一,北京),凝胶成像系统(G：BOX,Syngene,英国),正畸镍钛弹簧(CS-12-9,埃蒙迪,上海),正畸不锈钢结扎丝(2.0,康桥,上海)。

1.2 方法

1.2.1小鼠基因分型 提取3周～4周龄仔鼠尾(0.5～1 cm )基因组DNA,根据北京集萃药康提供的序列(表1),进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳,化学发光凝胶成像系统分析条带大小。扩增产物只有294 bp左右条带为CB2-/-小鼠;只有392 bp左右条带为WT小鼠;扩增产物有294 bp和392 bp左右2条电泳条带则为CB2杂合型小鼠(CB2+/-)(图1)。

图1 小鼠Cnr2基因PCR产物电泳图

表1 引物信息

1.2.2实验分组 选取体质量22～23 g的CB2-/-和同窝WT鼠雄性小鼠各30只,6周龄时建模,WT小鼠作为对照组,CB2-/-小鼠作为实验组,接受牙移动装置,建模时间分别为0、3、7、14和21 d;2种基因型的0 d组(n=6)小鼠均作为阴性对照,不做任何处理。

1.2.3建模方法 腹腔注射戊巴比妥钠(0.008 ml/g)麻醉小鼠。经正畸镍钛螺旋拉簧(丝径0.3 mm)的一端通过0.2 mm不锈钢结扎丝固定于左侧上颌第一磨牙上,另一端通过流动性修复树脂直接粘结到上颌切牙上,固定的结扎丝两端之间共计8圈弹簧,使用测力计准确测量装置力值,施力装置在30～40 ℃之间,提供恒定且持续的约20 g的力值,实验期间不需要重新激活[5],上颌第一磨牙近中移动(图2)。所有小鼠术后均给予软食,术后每天检查施力装置在模型鼠口内状态。

图2 小鼠牙移动模型口内图

1.2.4牙移动距离测量 在实验的第0、3、7、14和21天,样本选取左侧上颌牙槽骨和牙在内的横断区域,使其根方横断面垂直于上颌合平面,获取体视显微镜图片,使用Image J软件,测量图片中左侧上颌第二磨牙测量图片中左侧上颌第二磨牙近中边缘嵴的中点至第一磨牙近中边缘嵴的中点之间的距离,然后减去第一磨牙近远中径,获得牙移动距离。

1.2.5组织学观察 HE染色观察第一磨牙远中根牙周膜和压力侧牙槽骨的形态结构。Image J测量第一磨牙远中根压力侧牙周膜宽度,通过自第一磨牙远中根近中最凸点(根中1/3区域内)作垂直于远中根的延长线,获得该线延长至第一磨牙远中根压力侧牙槽骨的距离。TRAP染色统计左侧上颌第一磨牙远中根压力区附着于硬骨板表面凹陷的TRAP(+)破骨细胞数量。MMP-9抗原免疫组化染色统计左侧上颌第一磨牙远中根压力区MMP-9的阳性表达细胞数量。

2 结果

2.1 成功构建CB2-/-和WT小鼠OTM模型模型鼠术后健康,无基因型差异,每种基因型纳入30只OTM手术成功模型。

2.2 牙移动距离测定OTM 距离增加与施力时间呈正比,3 d组的OTM 距离最小,21 d组的OTM 距离最大。牙移动3、7、14和21 d组中,CB2-/-小鼠牙移动距离均较WT小鼠增加(图3、表2),差异有统计学意义(P<0.000 1)。

图3 不同时间两组小鼠的牙移动距离

表2 牙移动距离分析

2.3 组织学改变0天WT小鼠牙周膜纤维排列正常,牙槽骨硬骨板清晰完整,骨小梁交织成网状,CB2-/-小鼠骨小梁较WT小鼠稀疏。OTM 3 d时近远中牙周膜间隙宽度不一致,在压力侧变窄,张力侧变宽,两种基因型OTM小鼠差异无统计学意义。OTM 7和14 d时CB2-/-小鼠压力区牙周膜间隙宽度大于WT小鼠(图4、图5、表3)。

图4 OTM牙周组织变化 HE×200

图5 第一磨牙远中根压力区牙周膜宽度分析

表3 第一磨牙远中根压力区牙周膜宽度分析

2.4 牙移动压力区破骨细胞数量观察破骨细胞位于压力区硬骨板骨吸收陷凹内呈酒红色阳性颗粒。0 d组2种基因型小鼠的第一磨牙远中根压力区硬骨板均无破骨细胞。OTM 组3 d时 WT和CB2-/-小鼠的压力区硬骨板上出现了少量破骨细胞。OTM 组7 d时2种基因型小鼠的破骨细胞数量与3 d组相比均增加,且CB2-/-小鼠的破骨细胞数量大于WT小鼠,差异有统计学意义(P<0.01)。OTM 组14 d时CB2-/-小鼠的破骨细胞数量大于WT小鼠,差异有统计学意义(P<0.001)。但14和21 d时CB2-/-小鼠的破骨细胞数量变化不大,表明在14 d时CB2-/-小鼠的破骨细胞数量达到峰值;而WT小鼠在第21天时数量达到最大值(图6、图7、表4)。

图6 TRAP染色结果 ×200

图7 OTM压力区破骨细胞数量分析

表4 OTM压力区破骨细胞数量分析

2.5 牙移动压力区破骨细胞的早期募集和破骨活性观察MMP-9(+)单核细胞晚期前体多位于牙周膜间隙,呈深黄棕色着色;MMP-9(+)多核细胞多位于硬骨板骨吸收陷凹内多核且胞质呈深黄棕色着色,有时可见明显伪足(图8)。0 d组CB2-/-小鼠的压力区牙周膜区域MMP-9(+)单核细胞数量有大于WT小鼠的趋势,但2种基因型小鼠均未见MMP-9(+)多核细胞。3和7 d时WT型和CB2-/-单核细胞和多核细胞数量差别无统计学意义。OTM 组14 d时,CB2-/-小鼠的MMP-9(+)单核细胞和两种基因型的多核细胞数量达到最大值,且CB2-/-小鼠的MMP-9(+)单核细胞和多核细胞数量均大于WT小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)(表5、6)。

图8 OTM 压力区MMP-9(+)单核细胞和MMP-9(+)多核细胞数量

表5 MMP-9(+)单核细胞数量

表6 MMP-9(+)多核细胞数量

3 讨论

研究显示正畸力值达到一定强度时,破骨细胞数量出现峰值,更大的力值则不会增加牙齿移动距离且引起牙根吸收[6]。为获最佳牙移动和破骨细胞募集,所有加力装置均采用20 g力值。螺旋弹簧模型提供恒定和连续的力,防止牙周炎样组织反应,对建模牙齿的牙周组织的干扰最小[7]。为尽可能实现标准化OTM模型,本研究使用精心设计的镍钛弹簧的施力装置。机械刺激有助于破骨细胞活化和骨吸收,但长期的机械刺激骨吸收程度反而下降[8]。研究[9]显示OTM过程中牙槽骨阻力增加,3周后的大鼠牙齿移动减缓。本研究选择观察3周内的OTM模型。结果表明OTM模型成功建立,未发现明显的牙根吸收和牙周炎症,3周的观察时间比较合理。CB2属G-蛋白偶联受体,其配体结合部位是7个跨膜螺旋相互作用形成的中央核心。CB2激活后,通过跨膜区的构象变化,将生化信息传递到细胞内,从而引发一系列生理活动,参与骨代谢[2],在牙周组织中广泛表达,包括连接上皮、牙龈结缔组织、牙周膜和牙槽骨表面[10]。牙移动速率是决定正畸治疗疗程的直接决定因素,缩短正畸治疗周期的关键在于加速OTM,而压力侧牙周组织改建是OTM限速的关键,本研究主要关注CB2对正畸牙齿移动速率的影响,观察小鼠CB2基因敲除后在正畸力作用下压力侧牙周组织的改变。结果显示CB2-/-小鼠牙移动距离和压力区牙周膜间隙宽度均较WT小鼠增加,提示CB2与牙齿移动速率相关。此外,Konermann et al[11]发现牙周膜细胞连续拉伸 20%的状态下,在第48 小时,CB2 的蛋白表达下调。钱红 等[12]发现CB2抑制可下调牙周膜细胞中机械牵张力引起的成骨基因高表达。以上研究表明CB2表达受机械力的影响,且在骨改建中起重要作用。因此,结合所有研究,推测CB2缺失通过促进骨改建,最终加速OTM。OTM 压力侧骨吸收是决定OTM速度的限速步骤,而OTM 压力侧的破骨细胞数量和骨吸收活性决定骨吸收速度。TRAP是破骨细胞的标志性酶,特异性分布于破骨细胞中。本研究中,OTM CB2-/-小鼠的TRAP阳性破骨细胞数量上调,表明CB2缺失影响破骨细胞的活性。Ofek et al[13]发现激活CB2通过促进成骨前体细胞有丝分裂扩大前成骨细胞数量,同时通过减少破骨前体细胞有丝分裂,抑制破骨细胞分化,以此参与骨重建过程。有研究[4]发现CB2缺乏可通过上调破骨细胞和破骨前体细胞数量导致牙槽骨低骨量表型。本研究结果与之基本一致,因此推测CB2缺失通过促进破骨细胞的分化,增加破骨细胞数目和骨吸收活性,加速压力侧骨吸收。MMP-9是一种前体和成熟破骨细胞的标志物,在OTM压力区组织中高表达[7],机械力诱导的骨吸收过程促进破骨细胞的早期募集及提高骨吸收活性[14]。本研究结果提示CB2-/-小鼠较WT小鼠有更明显的破骨细胞的早期募集。Zhu et al[15]发现CB2激动剂可抑制骨髓来源破骨细胞前体的分化和破骨能力,下调MMP-9和TRAP的表达。提示CB2缺失通过促进机械刺激性破骨细胞的早期募集及提高骨吸收活性促进压力侧骨吸收。综上,CB2缺失通过促进机械刺激性破骨细胞的早期募集及提高骨转换促进正畸牙齿移动,但是其中参与的信号通路还有待于进一步研究。

CB2积极参与正畸牙移动过程,CB2缺失通过调节机械刺激性破骨过程参与正畸骨吸收过程,提高牙移动速率。提示靶向干预CB2的表达或可为正畸牙齿移动的精准干预的潜在靶点提供新的思路和线索,同时为临床上加速牙移动和缩短正畸疗程提供基础研究数据。本研究尚有不足,仅从功能表型层面探讨CB2缺失在加速牙移动中的作用,应结合体外实验,从分子、细胞、组织等不同级别进一步探究该作用背后的具体机制。