肺腺癌中通过靶向CDT1抑制肿瘤生长及其机制研究

米 源,梁宇翔,王 聪,李德思,宋春涛,苏 洁,张庆财,王 雷

肺癌是癌症相关死亡的主要原因,2018年全世界估计有210万新发肺癌诊断,占全球癌症负担的12%。在这一年估计有180万例病人死于肺癌,占全球癌症死亡的五分之一[1]。而肺腺癌是最常见的非小细胞肺癌的病理类型。近几十年来,随着分子靶向治疗和免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的发展在一定程度上提高了肺腺癌患者的生存率。然而,肺腺癌患者5年生存率仍为19%[2]。因此,迫切需要寻找新的靶点,以优化个性化治疗并提高患者生存率。从公共数据库下载肺腺癌患者的基因数据,通过分析显示染色质许可和DNA复制因子1(chromatin licensing and DNA replication factor 1,CDT1)是差异基因。CDT1对于DNA复制的启动是必不可少的,在细胞复制和周期调节过程中发挥了重要作用[3]。近年来,有研究表明CDT1与前列腺癌[4]、急性淋巴细胞白血病[5]等多种肿瘤的发生发展及预后相关。然而,CDT1在肺腺癌的发生发展的具体调控作用及预后的意义未见明确报道。该文旨在探索CDT1在肺腺癌中的表达、临床意义及潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料人肺腺癌细胞系A549及20对临床肺腺癌及正常标本均由河北医科大学第四医院保存。CDT1过表达载体pEGFP-N1-CDT1和对照载体pEGFP-N1(上海,生工生物工程股份有限公司),si-CDT1和对照si-NC(苏州吉玛生物科技有限公司),CDT1和GAPDH引物(美国Thermo Fisher),反转录试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司),PCR试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司),CDT1兔抗人单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),TPX2兔抗人多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),p53兔抗人多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),GAPDH鼠抗人单克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)。EDU试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),Transwell膜嵌套(美国Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1生物信息分析 TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)数据库下载肺腺癌组织及正常组织基因表达,R语言limma包进行差异表达分析,将P<0.05且log2(foldchange)>1作为差异基因的标准,R语言ggplot2包进行火山图制作,pheatmap包进行热图的制作;survival、timeROC包进行cox回归分析及制作ROC曲线,corrplot包进行相关性分析;GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)数据库信息进行肺腺癌CDT1表达的变化。

1.2.2细胞培养和转染 肺腺癌A549细胞系培养于含有10%胎牛血清的DMEM的高糖培养基中,在5%的CO2、37℃恒温培养箱中培养,待细胞长到90%左右用含0.25%胰蛋白酶EDTA消化液(不含酚红)消化细胞,进行1 ∶2传代培养。将呈对数生长期的细胞接种于6孔板上,细胞生长到50%～60%时,更换无血清培养基,并按照LipofectamineTM3000说明书进行siRNA的转染,设立实验si-CDT1组和对照si-NC组。24 h提取mRNA,48 h后收集蛋白。

1.2.3实时荧光定量PCR法检测基因的表达 将组织或细胞用裂解液进行裂解,按照RNA提取试剂盒说明书提取各组样本RNA,测定各组RNA浓度,按反转录试剂盒进行cDNA的反转录。按PCR试剂说明书进行基因扩增。以GAPDH的Ct值作为内参,采用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.4Western blot法检测相关蛋白表达 PBS洗涤转染后的A549细胞,用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液收集蛋白,按BCA试剂盒测定总蛋白的浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。冰水浴转到PVDF膜。室温用含5%脱脂奶粉液封膜进行封闭,4 ℃分别加入一抗过夜。次日用TBST洗膜并与二抗孵育1.5 h,最后用ECL试剂来可视化蛋白质条带,用Image软件检测蛋白条带的表达。

1.2.5流式细胞术检测细胞周期及增殖的变化 将转染的A549细胞用75%乙醇制备成单细胞悬液,固定6 h以上后用冷PBS漂洗3次,加入碘化吡啶注意避光。上机检测周期的变化。收集各组细胞,按照EDU试剂盒说明书进行处理,上机进行检测。

1.2.6Transwell侵袭实验 收集转染后的A549细胞吹打为单细胞悬液进行细胞计数,重悬在无血清培养液中,在上室加入10×104个细胞的培养液。下室加入含10%血清的培养液600 μl,放入细胞培养箱中培养24 h。24 h后经清洗、固定、染色、晾干后在倒置显微镜下(×200)视野随机选取4个视野,观察穿膜细胞数取平均值。

2 结果

2.1 CDT1生物信息筛查结果及组织表达TCGA数据库下载肺腺癌组织表达结果显示CDT1在肺腺癌中高表达(图1A、B);GO分析表明CDT1与细胞纺锤体组装相关(图1C);GEPIA数据库信息说明在肺腺癌组织中CDT1高表达,课题组也通过PCR检测临床20组样本验证了数据库信息的准确性,差异有统计学意义(P<0.000 1)(图1D、E)。

图1 生物信息结果及CDT1在肺腺癌组织中表达

2.2 CDT1表达对肺腺癌预后的影响对TCGA数据库中肺腺癌患者的数据进一步分析,通过单因素Cox及多因素Cox分析结果均显示CDT1的表达可作为独立的预后指标(P<0.001)(图2A、B);通过绘制生存曲线,CDT1与肺腺癌患者的预后相关(P=0.032)(图2C),绘制CDT1表达水平的ROC曲线,然后计算了ROC曲线下面积(AUC)。对肺腺癌患者1年、3年、5年生存时间的AUC分别为64.3%、62.8%和57.7%,表明CDT1可能是肺腺癌患者预后的预测生物标志物(图2D)。

图2 CDT1对肺腺癌预后的分析

2.3 CDT1对免疫治疗的预测作用将CDT1表达量与免疫监测点表达量进行pearson相关性分析,具体数值结果(表1),总体相关性分析(图3A);肿瘤突变负荷(Tumor mutational burden, TMB)已被批准作为免疫检查点抑制剂的预测生物标志物,分析CDT1与肿瘤突变负荷的关系,结果表明CDT1的表达与肿瘤突变负荷成正相关,表明CDT1的表达与免疫治疗的疗效密切相关(图3B)。

图3 CDT1对免疫治疗的预测作用

表1 CDT1表达量与免疫监测点相关性分析

2.4 敲低CDT1在肺腺癌A549细胞中的功能变化通过PCR(t=30.36,P<0.000 1)及Western blot(t=8.801,P=0.000 9)验证了si-CDT1可以明显降低CDT1的表达,差异有统计学意义(图4A、B);流式细胞术显示si-CDT1组细胞增殖能力明显降低(t=6.093,P=0.003 7)(图4C);流式细胞术分析细胞周期显示si-CDT1组G0/G1期明显升高(t=11.72,P=0.000 3),差异有统计学意义(图4D);Transwll实验显示CDT1组细胞侵袭能力明显降低(t=11.52,P=0.000 3),差异有统计学意义(图4E)。

图4 沉默CDT1抑制A549细胞的增殖、侵袭

2.5 敲低、过表达CDT1后p53、TPX2的表达变化敲低CDT1后p53(t=3.434,P=0.026 4)表达相对于对照组表达明显升高,TPX2(t=12.35,P=0.000 2)表达明显降低,差异有统计学意义;过表达CDT1后p53(t=3.758,P=0.019 8)表达明显降低,TPX2(t=6.944,P=0.002 3)表达明显升高,差异有统计学意义。见图5。

图5 敲低、过表达CDT1后p53、TPX2的表达变化

3 讨论

肺癌是全球癌症死亡的主要死因,2020年全球有2 206 771例新发肺癌病例和 1 796 144例死亡病例[6],而肺腺癌又是其主要亚型。尽管近几十年来免疫治疗、放疗和手术切除等多模式治疗策略取得了长足进步,但治愈肺癌的结果仍不尽如人意,其5年生存率不到20%[6]。因此,迫切需要有效的肺腺癌生物标志物和新的治疗靶点。

有研究[7]表明CDT1与多种肿瘤的预后相关,但在肺腺癌中作用机制及预后未见明确报道。本研究中,数据库信息及临床样本显示CDT1在肺腺癌组织中高表达,因此CDT1有望作为肺腺癌治疗新的靶点。

TCGA数据库分析结果表明CDT1可作为预测肺腺癌的预后指标,高表达的CDT1患者与低存活率有关。并且1年内准确性是更高的。并且近年来,针对免疫检查点的免疫疗法的临床应用提高了临床疗效,改变了肺腺癌的治疗范式[8]。因此课题组将CDT1的表达与免疫监测点表达量进行了相关性分析,在这些分子中与CD276正相关最大, CD276是一种共刺激/共抑制分子,作为一种共刺激分子,CD276信号诱导细胞免疫及增强细胞毒性T细胞的生成,而作为一种共抑制分子可以抑制Treg细胞,从而诱导肿瘤免疫逃逸反应[9]。

最后本研究将CDT1的表达与肿瘤突变负荷(Tumor mutational burden, TMB)进行了相关性分析, TMB是指肿瘤细胞中体细胞突变的总负荷。高TMB患者可能对免疫治疗有反应。TMB已被开发作为免疫检查点抑制剂的一种预测性生物标志物[10]。该实验结果表明CDT1表达与TMB成正相关。综上结果表明CDT1的表达与肺腺癌的免疫治疗存在密切的关系。

随后CDT1对肿瘤细胞功能的影响进行了实验验证。通过siRNA敲低CDT1基因后,发现肺腺癌增殖能力下降,G0/G1期细胞明显增加。这与Cai et al[3]在前列腺癌细胞中也发现敲低CDT1抑制肿瘤的增殖及改变细胞周期的结果是相一致的。侵袭和转移的激活是癌症的主要特征之一[11]。又通过Transwell实验验证了敲低CDT1后细胞侵袭转移能力明显下降。Maimaiti et al[12]在乳腺癌中同样发现影响CDT1可以改变肿瘤的侵袭转移能力,本文结果与之一致。

接下来本研究进一步对CDT1可能影响肿瘤的通路进行了验证。首先通过肿瘤蛋白互作网络的结果发现CDT1与非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2(TPX2)关系密切。TPX2是有丝分裂纺锤体功能所需的微管相关蛋白,不仅在细胞周期中起作用,还参与肿瘤转移、凋亡等过程[13],同时Chen et al[14]发现在乳腺癌中靶向TPX2可以通过激活p53抑制肿瘤的增殖。Western blot显示敲低CDT1后,TPX2表达降低、p53表达增加,而过表达CDT1后相应蛋白的表达发生了相反的变化。综上结果表明敲低CDT1可能通过影响TPX2促进p53的表达达到抗肿瘤的结果。

本研究揭示了CDT1在肺腺癌的发生发展中的潜在意义和可能机制,但仍存在一定的局限性。首先,CDT的功能评估尚缺乏体内实验的验证。其次, CDT1的表达与预后意义需要多中心的临床样本去验证。最后,尽管这项研究表明CDT1在调节细胞周期和影响免疫治疗的机体分子机制有待进一步探索。

综上所述,本研全面系统地评价了CDT1在肺腺癌的发展及预后的影响。为肺腺癌的治疗确定了新的预后生物标志物和治疗靶点。