HMGB1基因敲除通过抑制TLR4/NF-κB通路减轻脓毒症小鼠急性肺损伤

张志斌,李瑞彤,郑卫伟,林雪容,牛宁宁,王 慧,苑 萌,韩树池,薛乾隆

脓毒症是机体对感染的反应失调而引起危及生命的器官功能障碍,肺脏是脓毒症进程中受累的首位靶器官,急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是导致脓毒症患者死亡的主要原因之一。脓毒症ALI的病理生理机制复杂,包括炎症因子失控性释放、氧化应激反应激活等。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box B1,HMGB1)是一种存在于炎症反应晚期的炎症介质,其来源包括细胞主动分泌和被动释放,能够激活Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)、促进下游核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)核转位并一方面使炎症反应持续活化,另一方面促进自由基生成、引起氧化应激反应[1-2]。相关的临床研究[3]结果显示,脓毒症患者血清HMGB1含量增加且与肺脏、肾脏等脏器损伤相关;相关的动物实验[4-5]结果显示,多种药物减轻脓毒症ALI的治疗作用与抑制HMGB1表达有关。但HMGB1在脓毒症ALI发生发展中的生物学作用及相关机制尚不完全明确。该研究将通过基因敲除(knock out,KO)的手段分析HMGB1基因减轻脓毒症ALI及抑制TLR4/NF-κB通路的作用,为深入认识HMGB1在脓毒症ALI发生发展中的生物学作用及可能机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 野生型(wild type,WT)SPF级雄性C57BL/6J小鼠24只及HMGB1 KO雄性小鼠24只,体质量18～22 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。本研究经医院伦理委员会批准,实验过程遵循3R原则。

1.1.2试剂 RIIPA裂解液、核蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司),HMGB1、TLR4、NF-κB p65抗体(美国Abcam公司),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyd,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒(南京建成生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分组及建模 WT C57BL/6J小鼠分为WT-Sham组和WT-模型组,HMGB1 KO小鼠分为KO-Sham组和KO-模型组,每组12只。WT-模型组和KO-模型组采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症ALI模型,方法如下：造模前禁食12 h、自由饮水,腹腔注射1%戊巴比妥钠 50 mg/kg麻醉小鼠,摆放仰卧位并做长度2 cm的腹正中切口,分离盲肠并轻轻挤压盲肠近端粪便,使盲肠末充盈,在盲瓣与盲肠中点用无菌4号线结扎,在结扎部位与盲肠顶端中点用21G针头穿刺盲肠壁,将少许肠内容物轻轻挤出并保证穿孔处通畅,然后将挤出的内容物擦净,将盲肠还纳腹腔,最后关闭腹腔、缝合切口、完成造模。Sham组进行假手术操作如下：造模前禁食12 h、自由饮水,按照脓毒症ALI造模相同的方法麻醉及分离盲肠,在盲瓣与盲肠中点穿无菌4号线,但不进行结扎和穿孔操作,而后将盲肠还纳腹腔,最后关闭腹腔、缝合切口。

1.2.2血气分析 造模后24 h,腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉小鼠,再次做2 cm的腹正中切口,在小肠后方分离腹主动脉,用1 ml注射器在腹主动脉处抽取0.7 ml动脉血,采用i-STAT型血气分析仪(美国Abbott)进行动脉血气分析,检测动脉血氧分压(partial pressure of arterial oxygen,PaO2),计算氧合指数(oxygenation index,OI)=PaO2÷FiO2。

1.2.3血清炎症及氧化应激指标检测 造模后24 h,腹主动脉血进行血气分析后剩余的样本在4 ℃、3 000 r/min、半径10 cm条件下离心10 min,分离血清并采用试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ROS、SOD的浓度。

1.2.4肺组织病理改变检测 造模后24 h,取各组小鼠的左肺组织适量,经生理盐水清洗后用4%多聚甲醛固定,制作组织蜡块后切片,采用HE染色试剂盒对组织切片进行染色后在显微镜下观察肺组织的病理改变。采用半定量评分系统对肺病理改变进行评分,包括炎症、水肿、出血和肺泡间隔增厚4个项目,每项0～4分,合计评分即为肺损伤评分。

1.2.5肺组织湿重(W)/干重(D)比值测量 造模后24 h,取各组小鼠的右肺组织,称量湿重后将组织放入烘箱中,烘干至恒重后记录干重,而后计算W/D。

1.2.6肺组织中炎症及氧化应激指标检测 造模后24 h,取各组小鼠的左肺组织适量,剪碎后加入RIPA裂解液,加入放射免疫沉淀试验(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液匀浆后按照转速12 000 r/min、半径10 min、温度4 ℃离心10 min,取上清液,采用BCA法检测匀浆液的蛋白含量,采用试剂盒检测匀浆液中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ROS、SOD含量,计算每毫克匀浆液蛋白中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ROS、SOD的浓度。

1.2.7肺组织中蛋白表达的检测 取1.2.5中的匀浆液进行HMGB1、TLR4表达的检测;另取各组小鼠的左肺组织适量,剪碎后采用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白,进行核NF-κB表达的检测。检测时,将30 μg蛋白样本加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,而后电转移至硝酸纤维素膜,室温下5%脱脂牛奶封闭1 h,4 ℃下孵育HMGB1一抗(1 ∶500)、TLR4一抗(1 ∶1 000)、NF-κB一抗(1 ∶400)或β-actin一抗(1 ∶5 000)、LaminB一抗(1 ∶3 000)过夜。次日,洗膜3次后室温下孵育二抗(1 ∶2 000)1 h,最后在凝胶成像仪中进行化学显影,得到蛋白条带及对应的灰度值,以HMGB1/β-actin、TLR4/β-actin、NF-κB/LaminB的比值作为蛋白表达水平。

2 结果

2.1 4组小鼠肺组织中HMGB1表达的比较WT-模型组小鼠肺组织中HMGB1的表达水平高于WT-Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。KO-Sham组和KO-模型组小鼠肺组织中不表达HMGB1。见图1。

图1 4组小鼠肺组织中HMGB1表达的比较

2.2 4组小鼠肺损伤程度的比较WT-模型组小鼠PaO2、OI水平低于WT-Sham组,肺损伤评分、W/D比值高于WT-Sham组,差异有统计学意义(P<0.05);KO-Sham组小鼠PaO2、OI水平及肺损伤评分、W/D比值与WT-Sham组比较,差异无统计学意义;KO-模型组小鼠PaO2、OI水平高于WT-模型组,肺损伤评分、W/D比值低于WT-模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2。

表1 4组小鼠肺损伤程度的比较

2.3 4组小鼠炎症反应程度的比较WT-模型组小鼠血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度高于WT-Sham组,差异有统计学意义(P<0.05);KO-Sham组小鼠血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度与WT-Sham组比较,差异无统计学意义;KO-模型组小鼠血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度低于WT-模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组小鼠炎症反应程度的比较

2.4 4组小鼠氧化应激反应程度的比较WT-模型组小鼠血清及肺组织中MDA、ROS的浓度高于WT-Sham组,SOD的浓度低于WT-Sham组,差异有统计学意义(P<0.05);KO-Sham组小鼠血清及肺组织中MDA、ROS、SOD的浓度与WT-Sham组比较,差异无统计学意义(P>0.05);KO-模型组小鼠血清及肺组织中MDA、ROS的浓度低于WT-模型组,SOD的浓度高于WT-模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组小鼠炎症反应程度的比较

2.5 4组小鼠TLR4/NF-κB通路的比较WT-模型组小鼠肺组织中TLR4、核NF-κB p65的表达水平高于WT-Sham组,差异有统计学意义(P<0.05);KO-Sham组小鼠肺组织中TLR4、核NF-κB p65的表达水平与WT-Sham组比较,差异无统计学意义;KO-模型组小鼠肺组织中TLR4、核NF-κB p65的表达水平低于WT-模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 4组小鼠TLR4/NF-κB通路的比较

3 讨论

炎症细胞因子失控性释放与脓毒症ALI的发生发展密切相关,但具体的调控机制尚不完全清楚。HMGB1是重要的炎症介质,炎症反应激活过程中HMGB1的来源包括细胞主动分泌和被动释放,前者指单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等受到感染、缺血缺氧等刺激时主动合成和释放HMGB1,后者指组织细胞损伤后发生破裂、死亡并导致HMGB1被动释放。本研究中,脓毒症ALI小鼠肺组织中HMGB1表达增加。以上结果提示HMGB1高表达可能参与脓毒症ALI的发生发展,但脓毒症ALI中HMGB1的生物学作用尚缺乏直接的动物实验证据。

本研究采用基因敲除的手段对脓毒症ALI模型中HMGB1的生物学作用展开分析。野生型小鼠进行脓毒症ALI建模后PaO2及OI降低,肺组织出现间质充血水肿、炎症细胞浸润等典型的ALI病理表现且肺损伤评分增加,表明脓毒症ALI模型制备成功。HMGB1在脓毒症的发生和进展中发挥促炎作用,促进中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等向肺组织聚集,进而使炎症反应持续激活、肺损伤加剧[6-7]。本研究使用HMGB1敲除小鼠进行脓毒症ALI建模,敲除HMGB1使PaO2及OI增加,肺组织中间质充血水肿、炎症细胞浸润的病理改变减轻且肺损伤评分降低,这一结果为HMGB1参与脓毒症ALI提供了直接证据。

HMGB1促进炎症细胞浸润的效应不仅能够使TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子大量释放,炎症反应持续激活,还能使ROS生成增多,引起组织发生氧化应激损伤,增加脂质氧化产物MDA的生成及抗氧化酶SOD的消耗[8-9]。脓毒症ALI相关的基础研究证实炎症反应和氧化应激反应是与肺损伤密切相关的两种生物学因素,多种抗炎、抗氧化治疗手段显著减轻脓毒症ALI[10-12]。本研究中,野生型脓毒症ALI小鼠血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS、MDA的浓度均增加,SOD的浓度降低,符合脓毒症ALI发生发展中炎症反应和氧化应激过度激活的特征。HMGB1敲除使脓毒症ALI小鼠的血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS、MDA浓度降低,SOD浓度增加,表明HMGB1在脓毒症ALI中起到促进炎症反应及氧化应激的作用,敲除HMGB1使炎症反应及氧化应激减轻。

HMGB1促进炎症细胞浸润,调控炎症反应及氧化应激的机制可能与激活TLR4/NF-κB 通路有关。主动分泌和被动释放的HMGB1通过TLR4使NF-κB入核,进而启动多种炎症因子表达,导致“炎症瀑布”[13-14]。已有研究报道,脓毒症模型中TLR4及核NF-κB表达增加与肺损伤、肾损伤等脏器功能障碍相关[15]。本研究中,野生型脓毒症小鼠肺组织中TLR4及核NF-κB表达增加,与既往研究中TLR4/NF-κB 通路参与脓毒症ALI的结果吻合。HMGB1敲除使脓毒症ALI小鼠肺组织中TLR4及核NF-κB表达降低,表明脓毒症ALI中HMGB1调控TLR4/NF-κB 通路,敲除HMGB1使TLR4/NF-κB 通路受抑制,减少NF-κB入核,进而抑制NF-κB对多种炎症因子表达的促进作用,最终实现减轻炎症反应及氧化应激反应的效应。关于HMGB1调控TLR4的机制,可能涉及转录水平的启动子调控与转录后水平的非编码RNA调控,仍需今后设计相关的报告基因实验、mRNA稳定性实验等进行探索。

综上所述,HMGB1参与脓毒症ALI的发生发展,敲除HMGB1减轻脓毒症小鼠ALI,与之相关的分子机制可能是抑制TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应和氧化应激反应。TLR4/NF-κB通路在HMGB1参与脓毒症ALI发生发展中的作用仍有待今后更多的实验探索。