LINC00894通过miR-205-5p/ZEB1轴对胃癌细胞增殖和转移的影响

康伟彪,周理好,余昌俊,江 露,陈昌裕

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,全球每年新增胃癌病例达100万,因胃癌死亡病例达78.40万[1]。尽管目前治疗手段很多,但早期诊断率不高,针对胃癌的机制研究仍是目前研究的热点。长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,通常以疾病、组织或阶段特异性的方式表达,参与多种生物学过程,并在癌症的发生、发展中扮演重要角色[2-3]。课题组前期通过利用RT-qPCR技术对比胃癌及其配对癌旁组织中的数条lncRNA的表达差异,发现LINC00894在胃癌组织中的表达水平明显上调。近些年,有研究[4-7]表明LINC00894在一些肿瘤中高表达、发挥促癌作用,也有研究[8-9]显示LINC00894在肿瘤中扮演抑癌基因的角色。然而,目前关于LINC00894在胃癌中的研究较少。大量证据表明lncRNA可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),与miRNA相互作用从而吸附它们,降低它们对靶基因mRNA的调控效应[10]。因此,该研究通过细胞实验结合生物信息学分析,探索LINC00894基因对人胃癌细胞增殖、转移的影响,并验证LINC00894、miR-205-5p、ZEB1在胃癌中的调控关系。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

1.1.1主要细胞 人胃癌细胞系(MGC-803、AGS、BGC-823、NCI-N87、HGC-27)及人正常胃细胞系(GES-1)取自中国科学院上海细胞库。

1.1.2主要试剂 RPMI-1640、DMEM、Opti-MEM培养基和转染试剂Lipofectamine 2000(货号：11668-027)购于美国Invitrogen公司;血清购于美国Life Technology公司;总RNA提取试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司;LINC00894干扰质粒(LINC-KD1,LINC-KD2)、LINC00894过表达质粒(LINC-OE)、miR-205-5p模拟物(mimic)及其相应的阴性对照mimic control、miR-205-5p抑制物(inhibitor)及其相应的阴性对照inhibitor control、含miR-205-5p结合位点的野生型LINC00894荧光素酶报告质粒(LIN-WT)和miR-205-5p结合位点突变的突变型LINC00894荧光素酶报告质粒(LIN-MUT)、含有ZEB1基因3'UTR序列的野生型或突变型荧光素酶报告质粒(ZEB1-3U-WT,ZEB1-3U-MUT)均购于上海吉玛公司;双荧光素酶报告基因试剂盒和报告基因载体购于北京索莱宝科技有限公司;抗ZEB1抗体购于美国Abcam公司(货号：ab124512)(稀释度：1 ∶1 000);抗β-actin抗体购于美国Abcam公司(货号：ab8227) (稀释度：1 ∶1 000 );二抗购于美国Abcam公司(货号：ab97051)(稀释度：1 ∶6 000)。

1.1.3主要仪器 CO2培养箱(型号：NU-5810E)及生物安全柜(型号：NU-425-400S)均购于美国NUAIRE公司;倒置荧光显微镜(型号：DeltaVision)购于美国GE公司;微量核酸蛋白紫外分析仪(型号：Genove Nano)购于英国JENWAY公司;荧光定量PCR仪(型号：Step One Plus ABI)购于美国Thermo公司。

1.2 样本收集所有样本均收集于2011-2012年在安徽医科大学第一附属医院行手术治疗的胃癌患者术后标本,所有患者的纳入标准均为：无其它特殊疾病;术前未接受任何放疗、化学治疗、免疫治疗、靶向治疗或其它特殊治疗。所有胃癌患者的随访时间均超过5年,且所有纳入本研究的患者均签署了知情同意书。本研究经安徽医科大学机构审查委员会审查及批准,并严格遵照《赫尔辛基宣言》。

1.3 细胞培养与转染所有实验细胞均使用含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM或RPMI-1640培养基,并置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。采用说明书推荐的操作步骤,使用Lipofectamine 2000,对呈对数生长期的BGC-823和AGS细胞进行转染质粒,分为敲低组(LINC-KD1、LINC-KD2)、过表达组(LINC-OE)和对照组(Control),转染48 h后,提取总RNA或总蛋白,通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测针对LINC00894的敲低和过表达效率,以确定LINC00894敲减或过表达细胞模型是否构建成功;通过Western blot实验检测LINC00894与ZEB1之间表达水平的关系。

1.4 RNA提取与RT-qPCR细胞总RNA的提取、RNA的逆转录及RT-qPCR的方法参课题组前期发表的文章[11]。

1.5 Western blot实验胃癌细胞转染质粒48 h后,使用PBS溶液清洗细胞3次,然后用含有蛋白酶抑制剂的裂解液对细胞进行裂解,使用干净的细胞刮刮净培养皿中的液体,收集后并离心,提取细胞中的总蛋白,并检测总蛋白浓度。制备SDS-PAGE胶后,取20 μl的蛋白样品或Marker在SDS-PAGE胶中进行电泳分离,然后将蛋白转膜至PVDF膜上,丽春红染色后再次清洗PVDF膜,然后将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中室温封闭1 h,根据说明书加入稀释后的一抗(抗ZEB1抗体,1 ∶1 000;抗β-actin抗体,1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜,第2天使用PBST浸洗3次后,加入相应的二抗[山羊抗兔IgG H&L (HRP),1 ∶6 000],室温下孵育60 min后取出PVDF膜,再次使用PBST浸洗3次,最后加入显影液放在显影仪中进行显影并保存图片。

1.6 CCK-8实验胃癌细胞转染质粒48 h后,使用胰酶消化细胞后进行细胞计数,以每孔2 000个细胞的密度于96孔板种板,每组设置3个复孔,分别于种板后的第1、2、3、4天进行数据收集,数据收集前,每孔加入CCK-8试剂10 μl,孵育120 min后,收集450 nm波长的光密度(optimal density, OD)值。

1.7 克隆形成实验胃癌细胞转染质粒48 h后,使用胰酶消化细胞后进行细胞计数,以每孔600个的密度于6孔板种板,每组设置3个复孔,每隔3 d更换1次培养基,连续培养2周,待克隆形成后终止培养,弃去旧的培养基,并使用PBS溶液清洗细胞,去除原有残余培养基和细胞碎片等杂质,使用浓度为4%的多聚甲醛(1 000 μl/孔),固定20 min;弃去多聚甲醛后,使用0.1%的结晶紫溶液(1 000 μl/孔)染色1 h后,拍照并计数每组克隆形成数。

1.8 Transwell实验

1.8.1迁移实验 胃癌细胞转染质粒48 h后,使用胰酶消化细胞后进行细胞计数,用无血清培养基稀释细胞密度至5×105/ml,于Transwell 24孔板中加入600 μl完全培养基,向孔中安装Transwell小室,然后向上室加入200 μl目的细胞悬液,每组设置3个复孔,放入培养箱培养24 h后,90%乙醇固定0.5 h,0.1%结晶紫染色5 min后,最后,使用显微镜拍照并计数迁移细胞数。

1.8.2侵袭实验 于冰上预先配制基质胶工作混合液(基质胶 ∶无血清培养基=1 ∶8),吸取60 μl基质胶工作液于小室上层(小室放于Transwell 24孔板中),将24孔板放入细胞培养箱中超过2 h,按照相同的步骤将细胞悬液种植与小室上层,剩余步骤与迁移实验相同。

1.9 双荧光素酶报告实验使用生物信息学在线数据库starbase(https：//starbase.sysu.edu.cn)预测LINC00894靶基因,miR-205-5p与LINC00894具有互补结合位点,将结合位点突变,构建突变型荧光素酶报告质粒(LIN-MUT);同样使用starbase数据库预测miR-205-5p靶基因,ZEB1与miR-205-5p具有互补结合位点,将结合位点突变,构建突变型荧光素酶报告质粒(ZEB1-3U-MUT)。将LIN-WT或LIN-MUT分别与miR-205-5p mimic或mimic control共转染到BGC-823细胞中;将LIN-WT或LIN-MUT分别与miR-205-5p inhibitor或inhibitor control共转染到AGS细胞中;将ZEB1-3U-WT或ZEB1-3U-MUT分别与miR-205-5p mimic或mimic control共转染到BGC-823细胞中;将ZEB1-3U-WT或ZEB1-3U-MUT分别与miR-205-5p inhibitor或inhibitor control共转染到AGS细胞中。转染48 h后,利用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1LINC00894在胃癌中高表达且与不良预后有关RT-qPCR结果显示(图1A)：LINC00894在胃癌组织中的表达水平较胃正常组织明显升高(P<0.01);Kaplan-Meier生存曲线分析显示(图1B、C)：高表达LINC00894的胃癌患者具有更差的总生存期和无进展生存期;RT-qPCR结果显示(图1D)：LINC00894在胃癌细胞系中的表达水平较胃正常细胞系GES-1明显升高,其中在BGC-823细胞中表达最高,在AGS细胞中表达最低,因此,选择BGC-823和AGS细胞进行后续实验。

图1 LINC00894在胃癌中高表达且与不良预后有关

2.2LINC00894对胃癌细胞增殖的影响RT-qPCR结果显示(图2A)：敲低组LINC-KD1、LINC-KD2较对照组Control的LINC00894表达量下降(F=53.04,P<0.01);过表达组LINC-OE较对照(Control)组的LINC00894表达量上升(P<0.01)。

图2 LINC00894对胃癌细胞增殖的影响

此外,对LINC00894的敲低效率和过表达效率均超过50%,表明敲减和过表达模型构建成功。CCK-8实验结果显示(图2B)：与对照组比较,LINC00894敲低组(LINC-KD1、LINC-KD2)的OD值(450 nm)减小(F=26.21,P<0.01),而LINC00894过表达组(LINC-OE)(1.76 ± 0.21)的OD值(450 nm)增加,提示LINC00894基因的表达上调可提高胃癌细胞的增殖能力。克隆形成实验结果显示(图2C)：LINC00894敲低组(LINC-KD1、LINC-KD2)细胞形成克隆数较对照组减少(F=135.0,P<0.01),LINC00894过表达组(LINC-OE)细胞形成克隆数较对照组增加,且差异均有统计学意义,提示LINC00894基因的高表达显著增强胃癌细胞的克隆形成能力。

2.3LINC00894对胃癌细胞迁移、侵袭的影响Transwell迁移实验结果显示(图3A)：LINC-KD1、LINC-KD2组较Control组的迁移细胞数减少(F=75.77,P<0.01),LINC-OE组较Control组的迁移细胞数增加,且差异均有统计学意义(P<0.01)。Transwell侵袭实验结果显示(图3B)：LINC-KD1、LINC-KD2组较Control组的侵袭细胞数减少(F=70.46,P<0.01),LINC-OE组较Control组的侵袭细胞数增加,且差异均有统计学意义。以上结果提示LINC00894基因的高表达增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力。

图3 LINC00894对胃癌细胞迁移、侵袭的影响

2.4LINC00894与miR-205-5p和ZEB1的靶向关系生物信息学分析显示(图4A、B)：LINC00894与miR-205-5p、miR-205-5p与ZEB1具有互补序列,因此miR-205-5p可能是LINC00894的靶基因,而ZEB1可能是miR-205-5p的靶基因。双荧光素酶报告实验显示：在BGC-823细胞中,miR-205-5p mimic降低了LIN-WT组的荧光素酶活性,而LIN-MUT组的荧光素酶活性没有变化,在AGS细胞中,miR-205-5p inhibitor增强了LIN-WT组的荧光素酶活性,而LIN-MUT组的荧光素酶活性没有变化,以上结果提示LINC00894和miR-205-5p之间可能存在直接的相互作用(图4C);在BGC-823,miR-205-5p mimic降低了ZEB1-3U-WT组的荧光素酶活性,而ZEB1-3U-MUT组的荧光素酶活性没有变化,在AGS细胞中,miR-205-5p inhibitor增强了ZEB1-3U-WT组的荧光素酶活性,而ZEB1-3U-MUT组的荧光素酶活性没有变化,以上结果提示ZEB1和miR-205-5p之间可能存在直接的相互作用(图4D)。RT-qPCR结果显示(图4E)：在BGC-823细胞中,敲低组LINC-KD1、LINC-KD2较对照组Control的miR-205-5p表达量上升(F=42.17,P<0.01));在AGS细胞中,过表达组LINC-OE较对照组Control的miR-205-5p表达量下降。Western blot实验显示(图4F)：在BGC-823细胞中,敲低组LINC-KD1、LINC-KD2较对照组Control的ZEB1蛋白的表达量下降;在AGS细胞中,过表达组LINC-OE较对照组Control的ZEB1蛋白的表达量上升。以上结果表明：LINC00894通过靶向miR-205-5p并下调其表达,从而促进ZEB1的表达。

图4 LINC00894与miR-205-5p和ZEB1的靶向关系

3 讨论

随着对癌症机制的不断深入研究,lncRNA作为癌症的潜在生物标志物,已逐渐成为极具吸引力的癌症治疗靶点[12-13]。课题组前期通过荟萃分析发现[14],lncRNA在胃肠道肿瘤中具有预后价值,有望成为新的肿瘤预后标志物。近些年,多篇研究报道LINC00894在癌症中扮演着癌基因的角色,其中包括肾癌[4-6]和乳腺癌[7]。然而,有报道[8]说明LINC00894在抑制乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的进展方面也起到关键作用,此外,也有报道[9]说明LINC00894在甲状腺癌中同样发挥抑癌作用。由此可见,LINC00894的功能因肿瘤类型而异,这可能与组织异质性或基因的多功能性有关。

本研究中,LINC00894在胃癌中表达上调,且LINC00894高表达的胃癌患者往往预后更差。此外,LINC00894低表达后,CCK-8和克隆形成实验表明LINC00894的敲低对胃癌细胞的活力和增殖能力具有明显抑制作用;Transwell实验表明LINC00894的敲低对胃癌细胞的迁移和侵袭能力也具有显著的抑制作用。相反,LINC00894基因的过表达得到相反的结果,此数据与过去的研究[7]结果一致。因此,本研究表明LINC00894对胃癌细胞的增殖、转移具有促进作用。为了探究LINC00894调控胃癌细胞增殖、转移的潜在机制,本研究通过starbase数据库预测了“LINC00894/miR-205-5p/ZEB1”ceRNA调控机制,并通过双荧光素酶报告实验、RT-qPCR实验和Western blot实验检测了LINC00894、miR-205-5p和ZEB1三者之间的调控关系。实验结果表明,LINC00894与miR-205-5p、miR-205-5p与ZEB1存在直接结合,且LINC00894与miR-205-5p存在负调控关系,LINC00894与ZEB1存在正调控关系。过去的研究[7-8]表明,在乳腺癌中,LINC00894可通过ceRNA调控机制竞争性地结合miRNA,从而介导ZEB1的表达,此结论与上述数据一致。由此说明,在胃癌中,LINC00894可通过靶向miR-205-5p并下调其表达,从而促进ZEB1的表达。

综上所述,LINC00894在胃癌中扮演癌基因的角色,且LINC00894可能通过调控miR-205-5p/ZEB1生物轴促进胃癌细胞的增殖和转移,然而,具体的机制仍需进一步证实。本研究有望为胃癌的靶向治疗及预后预测提供新的线索。