KAT7促进软骨细胞衰老

王旭蕾,储柱平,王惠敏,魏 伟,严尚学

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种与衰老相关的关节退行性疾病,是世界范围内常见的致残性疾病,临床缺少有效治疗药物。OA的发展不仅与炎症或软骨基质的合成和降解失衡有关,关节组织中衰老细胞数量的增加也发挥着重要作用;年龄相关的线粒体功能障碍与氧化应激也可诱导关节组织细胞衰老[1-2]。尽管OA的确切机制不明,但衰老的一些特征在OA疾病进程中发挥重要作用。细胞衰老是衰老的标志之一,衰老细胞表达衰老生物标志物p53和p21,并表现出衰老相关的β-半乳糖苷酶活性增加[3]。基于CRISPR/Cas9的全基因组筛选确定赖氨酸乙酰转移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7/HBO1)是细胞衰老的驱动因素[4]。有研究[5-6]证实,软骨细胞衰老与OA疾病发展进程密切相关,深入阐明KAT7是否参与软骨细胞衰老对于了解OA病理机制具有重要作用。该研究拟建立过度复制诱导原代小鼠软骨细胞衰老模型及小鼠自然衰老模型,研究KAT7在软骨细胞及软骨组织衰老中的作用,为治疗或预防OA提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 雌性SPF级C57BL/6小鼠购于安徽省实验动物中心[许可证号：SCXK(皖)2020-001],饲养于SPF环境设施中[许可证号：SYXK(皖)2020-001],自由饮食;对照组(13～15 g)、实验组(22～24 g)各7只。

1.1.2主要试剂 Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma 公司;小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂购自中杉金桥;β-actin抗体购自美国 Affinity公司;KAT7抗体、p21抗体购自美国Abcam公司;p53抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司;SA-β-Gal染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.1.3主要仪器 激光共聚焦显微镜(型号：徕卡TCS SP8)、组织原位细胞扫描分析仪(型号：Pannoramic MIDI) 购于济南丹吉尔电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1软骨细胞的分离与培养 从10日龄 C57BL/6幼鼠的膝骨软骨中分离出原代软骨细胞。将小鼠CO2梯度处死后,无菌条件下获取双侧股骨及胫骨软骨,PBS冲洗3次,剪碎为1 mm3左右的软骨碎片后用巴氏吸管转移至15 ml离心管中,离心去除上层PBS,用1%二型胶原酶重悬,37 ℃消化6 h后用22 μm细胞滤器过滤消化液,离心弃上清液,加入10%血清的DMEM/F12培养基重悬细胞,后将细胞悬液转移至预先加有培养基的25 cm2的培养瓶中37 ℃培养。小鼠软骨细胞培养在添加有10% 胎牛血清的DMEM/F12培养基中,培养条件为37 ℃、5% CO2。

1.2.2软骨细胞的鉴定 以甲苯胺蓝染色与二型胶原(Col Ⅱ)免疫荧光染色进行软骨细胞鉴定。采用细胞爬片技术,细胞贴壁后取出盖玻片,4%多聚甲醛固定20 min,3%过氧化氢室温下孵育10 min,5% BSA封闭 10 min,滴加Col Ⅱ一抗,4 ℃过夜。 复温后滴加荧光二抗,室温下孵育2 h,DAPI染色8 min,滴加抗荧光淬灭剂,指甲油封片。对于甲苯胺蓝染色, 固定后用甲苯胺蓝染色 5 min,梯度乙醇脱水后常温干燥,中性树胶封片。

1.2.3Western blot检测软骨细胞衰老信号蛋白p53、p21及KAT7的表达 收集第八代软骨细胞(P8)及加入WM-3835干预的P8软骨细胞,提取细胞总蛋白,电泳、转膜、封闭,分别加入KAT7(1 ∶1 000)、p53(1 ∶1 000)、p21(1 ∶1 000)等一抗孵育过夜;分别加二抗(KAT7与p21为兔抗1 ∶10 000;p52为鼠抗1 ∶1 000) 37 ℃ 孵育 2 h,洗膜,显影。 Image J软件分析灰度值并进行统计分析。

1.2.4免疫荧光检测软骨细胞KAT7的表达 收集P8软骨细胞及加入WM-3835干预的P8软骨细胞,多聚甲醛固定,免疫染色通透液(TritionX-100)通透,使用与二抗相同来源的宿主血清封闭后加KAT7(1：500)一抗过夜;次日弃去一抗加入兔荧光二抗(1 ∶200)孵育2 h,DAPI染色8 min,滴入抗荧光淬灭剂,指甲油封片。

1.2.5病理学检测 取经10%福尔马林室温固定的软骨组织,脱钙后,石蜡纵向包埋,切片后进行HE ,番红O-固绿染色,镜下观察组织病理学改变。

1.2.6免疫组织化学方法检测p53、KAT7在软骨组织样本中的表达水平 软骨组织样本经处理后,脱钙包埋切片,分别用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修复液和 3%过氧化氢进行抗原修复并阻断内源性过氧化物的干扰,加入KAT7(1 ∶200)、p53(1 ∶500)一抗4 ℃孵育过夜,第2天室温复温后 PBS 洗涤,按照通用二步法免疫组化试剂盒(PV-9000)中说明书步骤：加入一抗增强液孵育30 min,增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物室温孵育20 min,加入适量新鲜配制的DAB显色液约3 min,苏木精复染后封片并在波片扫描仪下观察。

2 结果

2.1 软骨细胞的形态学观察经过两步酶消化法分离得到的原代软骨细胞为球形,呈悬浮状态,大小均一,具有较强的折光性。贴壁后的软骨细胞大部分呈圆形、椭圆形或短梭形,可见成簇现象。

2.2 软骨细胞的鉴定3代内的阳性软骨细胞甲苯胺蓝染色可见细胞内有蓝紫色异染颗粒;Ⅱ型胶原( Col Ⅱ)免疫荧光染色阳性软骨细胞可见细胞均有红色阳染情况(图1)。

图1 小鼠软骨细胞鉴定 ×100

2.3 过度复制对小鼠软骨细胞p53、p21及KAT7蛋白表达的影响及染色结果Western blot结果显示(图2),与第一代(P1)软骨细胞相比, P8软骨细胞p53、p21及KAT7的蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。SA-β-Gal染色可见,P8软骨细胞中SA-β-gal阳性的软骨细胞数高于对照组(图3)。

图2 过度复制软骨细胞衰老蛋白及KAT7的影响

图3 过度复制软骨细胞 SA-β-Gal染色×40

2.4 WM-3835对P8软骨细胞KAT7和p21表达的影响结果显示,P8软骨细胞KAT7蛋白表达量明显升高, 100 μmol/L WM-3835作用48 h可降低KAT7和p21的蛋白表达,差异有统计学意义(图4)。细胞免疫荧光结果也表明,与P1软骨细胞相比,P8软骨细胞KAT7荧光强度(红色)增强,WM-3835体外可降低KAT7荧光强度(图5)。

图4 WM-3835抑制对衰老软骨细胞KAT7及p21表达的影响(n=3)

图5 WM-3835体外对P8软骨细胞KAT7荧光强度的影响 ×400

2.5 不同年龄软骨组织的病理变化显微镜下检查可见,年轻小鼠软骨组织中无异常分化细胞,软骨细胞分布较均匀,大小和形态一致;老龄小鼠软骨组织呈现近骨性分布,软骨细胞数量减少,空泡化明显,软骨表面完整性降低,关节表面不平整(图6)。

图6 不同年龄软骨组织的病理变化 ×100

图7 不同年龄小鼠软骨中的KAT7和p53的表达 ×100

2.6 不同年龄小鼠软骨组织中KAT7和p53的表达免疫组化法检测年轻小鼠(2月龄)与老龄小鼠(22月龄)软骨组织KAT7和p53表达水平,结果显示22月龄小鼠软骨组织中KAT7和p53表达水平相比于2月龄明显升高。

3 讨论

细胞衰老是衰老的标志之一,软骨细胞在衰老的过程中具有许多衰老细胞的特征。衰老细胞的慢性积累与年龄相关的疾病有关,其中骨性关节炎是一种常见的关节疾病,晚期骨性关节炎患者的软骨中大量存在衰老细胞。尽管当软骨细胞衰老而停止分裂时,它们仍然保持代谢活性,分泌多种炎症细胞因子、趋化因子、生长因子和许多更可溶和不可溶的蛋白酶,这些蛋白酶被称为衰老相关分泌表型(SASP);SASP改变组织微环境,影响周围细胞和组织炎性因子浸润,进而促进关节炎的发生[7]。

KAT7(HBO1或MYST2)是一种乙酰化H3和H4组蛋白的组蛋白乙酰转移酶;它由一个N-末端结构域和一个C-末端MYST结构域组成,这是乙酰辅酶a结合和乙酰化所必需的[8]。HBO1在调节许多关键的细胞行为和生理功能方面至关重要,包括基因转录、蛋白质泛素化、免疫调节、干细胞多能性、自我更新维持和胚胎发育等。已有研究[4]证实,KAT7是人间充质前体细胞衰老的有力驱动因素,对于肝细胞和人间充质前体细胞衰老具有明显的促进作用,使用KAT7抑制剂WM-3835可延缓肝细胞和人间充质前体细胞的衰老;KAT7还是MSCs衰老的驱动因素,有文献[9]通过体外研究发现衰老MSCs中KAT7表达量上升,且β-胡萝卜素可通过调节KAT7 - P15信号轴抑制衰老。OA是一种与年龄相关性极高的关节疾病,软骨组织和软骨细胞是否发生衰老过程,KAT7是否参与了软骨组织衰老,尚未见文献报道。

本研究中,与P1小鼠原代软骨细胞相比,P8软骨细胞的p53、p21和KAT7蛋白表达水平升高,SA-β-Gal也显示阳染增多;WM-3835作为一种KAT7抑制剂,可结合在KAT7乙酰辅酶A的结合位点上使KAT7失活[10],体外使用WM-3835(100 μmol/L)可以降低P8软骨细胞中KAT7和衰老标志物p21的表达。这些结果提示,P8软骨细胞产生了“复制性衰老”, KAT7在小鼠软骨细胞衰老模型中发挥促进作用。比较不同年龄小鼠的关节组织显示,与年轻小鼠相比,老龄小鼠软骨组织呈现近骨性分布,空泡化严重,软骨表面完整性降低,p53和KAT7表达明显上调,提示KAT7与老龄小鼠的软骨组织衰老密切相关。Western blot和细胞免疫荧光确定在衰老软骨细胞中KAT7表达升高;在衰老小鼠软骨组织切片中使用免疫组化和免疫荧光的方法同样证明与年轻小鼠相比,衰老小鼠软骨组织中KAT7表达上调,说明KAT7与衰老息息相关。

综上所述,本研究在成功建立小鼠原代软骨细胞产生复制性衰老模型及小鼠自然衰老模型的基础上,明确了KAT7在软骨细胞衰老过程中的作用,KAT7或可成为软骨衰老新的标志物。