2020-2022年海南省诺如病毒胃肠炎暴发疫情分子流行特征分析

曾云婷,陈海云,李丹丹,杨艳辉,靳 淼,黄 琼,崔 蕾,潘正帆,任莉娜,遇晓杰

NoV是引起世界人AGE暴发流行的最重要病原,感染所有年龄组[2-3]。据估计,NoV感染占全球AGE病例的18%;所有胃肠炎暴发中,50%由诺如病毒引起[4]。该研究首次对海南地区开展2020至2022年AGE暴发NoV的3年连续监测并确定其分子流行特征,为海南省NoV暴发的预防和控制提供科学依据并完善数据资料,为下一步开展海南省病毒性腹泻网络监测工作打下基础。

1 材料与方法

1.1 海南省胃肠炎暴发监测《诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)》指出,NoV暴发定义为3 d内同一场所发生3例及以上急性胃肠炎病例,其中至少2例NoV实验室诊断病例;AGE定义为24 h内出现3次及以上大便和/或2次呕吐。2020年1月至2022年12月,海南省疾控中心收到8个市/县疾控中心(定安县、文昌市、澄迈县、临高县、白沙县、乐东县、东方市和万宁市)报送的胃肠炎暴发中采集的肛拭子标本及相关流行病学、临床信息。海南省疾病预防控制中心对标本进行NoV检测和基因分型。

1.2 病毒核糖核酸的提取肛拭子样品加入2 ml磷酸缓冲液,旋涡振荡混匀,取200 μl上清液,使用西安天隆qEx-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒进行初筛,用罗氏公司提供的High Pure Viral RNA Kit进行待测序样品的提取核酸。

1.3 NoV检测和分型采用实时荧光诺如病毒检测试剂盒(江苏硕世生物科技股份有限公司)对样本进行分型检测,选择CT值≤30的阳性样本用另一实时荧光诺如检测试剂盒(深圳生科原生物有限公司)进行复检,以备扩增测序待用。待测序样本采用分型 RT-PCR 扩增,对聚合酶(ORF1)和衣壳区(ORF2)基因片段同时进行分型,使用一步法RT-PCR试剂盒OneStep RT-PCR kit(德国凯杰公司,货号210212),引物MON432和G1SKR对GI组NoV分型,MON431和G2SKR对GII组NoV分型(ref)。反应条件：42 ℃、30 min;95 ℃、15 min;40个循环包括95 ℃、1 min、50 ℃、1 min和72 ℃、1 min;72 ℃、10 min。

1.4 基因组扩增real-time RT-PCR检测阳性但CT值高于30以上的样品因其病毒载量较低测序很难成功等原因,故成功获得了13起暴发的测序和分型。根据全国流行的情况,GⅡ.2[P16]4株、GⅡ.3[P12]2株和GⅡ.4 Sydney[P31]为主要的流行株,对这3种基因型8株毒株进行扩增,其方法和引物序列如文献所示[5]。

1.5 测序和序列分析RT-PCR产物送北京天一辉远生物科技有限公司。使用ABI 3730XL测序。测序结果应用DNAStar V7.10进行序列拼接,应用MEGA 5.0软件进行比对和系统进化分析。

1.6 关键氨基酸位点分析利用MAFFT软件进行多序列比对对齐;利用MEGA 5.0软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列,并对关键位点进行比对分析;利用WebLogo 3工具将关键氨基酸位点分析结果可视化,每个氨基酸的字体大小与每个位置的保守百分比成比例。底部数字表示氨基酸位置,以不同颜色表示活性位点(紫色)、预测的抗体结合位点(红色)和HBGA结合位点(绿色)。氨基酸根据其化学性质而具有颜色：极性氨基酸(G、S、T、Y、C)显示为绿色,中性(Q、N)显示为紫色,碱性(K、R、H)显示为蓝色,酸性(D、E)显示为红色,疏水性(A、V、L、I、P、W、F、M)氨基酸显示为黑色。

无论是酯、酸酐还是酰氯，其与有机锂试剂反应而生成的中间产物是不稳定的，在过程中即可分解为酮，所以在产物中常是酮和3°ROH的混合物。

1.7 统计学处理利用Excel 2019 整理数据、绘制图表,用Arc GIS软件进行地图绘制,采用描述性统计学方法对疫情数据进行分析,计数资料的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流行病学情况2020-2022年海南省共收集胃肠炎暴发39起,根据real-time RT-PCR检测结果,按照监测暴发定义来自中国疾控中心发布的《诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)》,确认NoV暴发25起(64.1%,25/39),其中GI、GII、GI/GII混合引起的暴发数分别为3起、21起和1起。NoV暴发数最多出现在2021年2月(4起),其次是2020年7月和9月(各3起)(图1)。根据场所分布,NoV暴发主要集中在托幼机构和学校(幼儿园15起、小学3起、中学2起),占80.0%;居民区2起,餐点、建筑工地和养老院各1起。根据地理分布(图2),NoV暴发主要集中在海口周围县(东北部),包括定安(5起)、文昌(4起)、澄迈(4起)和临高(3起);其次集中在中西部,包括白沙(2起)、乐东(2起)和东方(3起);东南部万宁1起。

图1 2020-2022年海南省NoV胃肠炎暴发时间分布图

图2 2020-2022年海南省NoV胃肠炎爆发地区分布图

在25起NoV引起的胃肠炎疫情中,共计检出NoV阳性样本119例,其中GI 9例、GII 110例,2～6岁NoV阳性76例(含GI 2例),男性构成比65.79%(50/76),女性34.21%(26/76),其阳性构成比男性高于女性,经χ2检验,P<0.05;7～17岁阳性14例,男性构成比71.43%(10/14),女性28.57%(4/14),其阳性构成比男性高于女性,经χ2检验,P<0.05;18～40岁阳性13例,男性5例(建筑工地),女性8例(其中7例在幼儿园,1例在居民区),与职业有关联;55岁及以上人群阳性16例(含GI 7例),男性构成比18.75%(3/16),女性71.25%(13/16),其阳性构成比女性高于男性,经χ2检验,P<0.05。

2.2 基因型与流行病学特征根据RT-PCR分型及测序,13起诺如病毒暴发获得分型结果,均为GⅡ组诺如病毒,检出4种基因型,GⅡ.2[P16]为主要流行株,占60%(9/13),其他3种基因型为GⅡ.4 Sydney[P31](15.4%,2/13)和GⅡ.4 Sydney[P16](7.7%,1/13)和GⅡ.3[P12](7.7%,1/13)。GⅡ.2[P16]集中在2020年8月至2021年2月,9月检出最多,为3起。GⅡ.4 Sydney[P31]在2021年2月和2022年2月检出各一起。GⅡ.4 Sydney[P16]和GⅡ.3[P12]分别在2021年6月和2022年3月检出(图1)。9起GⅡ.2[P16]引起的暴发中,7起发生在幼儿园,中学和建筑工地各1起;年龄主要集中在2～6岁(14/21),7～17岁3人,18～40岁4人。他基因型引起的暴发均发生在幼儿园,年龄均集中在2～6岁。

2.3 基因组进化分析本研究获得8株诺如病毒基因组序列,包括GⅡ.2[P16]4株、GⅡ.3[P12]2株和GⅡ.4 Sydney[P31]2株,除2株GⅡ.3[P12]毒株来自同一起暴发外,其他均来自于不同起暴发。

GⅡ.2衣壳区主要分为3个亚群,包括Cluster I(2008～2012)、ClusterⅡ(2016～2012)和ClusterⅢ(2016～2022),本研究4株GⅡ.2[P16](2020年3株和2022年1株)与ClusterⅢ划分为1个亚群(图3)。Reemerging GⅡ.P16亚群进一步可以分为4个亚群Cluster I-IV,本研究分离的4株GⅡ2.[P16]在RdRp区与ClusterⅢ划分为同一亚群(图4)。

图3 2020-2022年海南省8株NoV毒株VP1区进化树

图4 2020-2022年海南省8株NoV毒株RdRP区进化树

GII.P31 RdRp区序列主要分为3个群。根据RdRp区系统进化分析,本研究获得的2株GⅡ.4 Sydney[P31]属于ClusterⅢ(图4)。VPI也相应分为3个群(ClusterI-Ⅲ),本研究获得的2株GII.4 Sydney[P31]属于ClusterⅢ(图3)。

GII.3[P12]在衣壳区属于4个群,包括Cluster I(2008～2012)、Cluster Ⅱ(2015～2016)、ClusterⅢ(2020～2022)和ClusterⅢ(2022),本研究获得的2株GⅡ.3[P12]属于Cluster IV(图3)。GII.3[P12]在聚合酶区分为3个群(Cluster),本研究获得的2株GII.3[P12]属于ClusterⅢ(2016-2022)(图4)。

2.4 基因组氨基酸位点分析

2.4.1GⅡ.3[P12] 本研究分别收集了72条GⅡ.3 VP1和112条GⅡ.P12 RdRp序列进行氨基酸位点变化比较。RdRp区有8个独特的氨基酸取代,其中氨基酸位点S4A(11.6%)、K76A(43.7%)和V91I(10.7%)取代频率较高,其他氨基酸均比较保守(图5A)。VP1区存在27个氨基酸取代。 9个在NS结构区,其中T9A(40.2%)、D30E(40.2%)、V179I(47.2%)和D209G(45.8%)替代频率较高(图5B、C);5个在P1区,包括T228S(23.6%)、A476S(22.2%)、T478S(15.2%)、N510S(9.7%)和I547V(45.8%)(图5B);15个在P2区,其中V289T(22.2%)、A368S(47.2%)、G385D(40.2%)、H404N(26.3%)、A406S(19.4%)和S417A(22.2%)替代频率较高(图5C)。

图5 2020-2022年海南省8株诺如病毒毒株基因点位分析图

2.4.2GⅡ.2[P16] 本研究收集了91条GⅡ.2VP1序列和112条GⅡ.P16 RdRp序列进行氨基酸位点变异情况分析。结果表明,VP1区,P2亚区的G354A位氨基酸(23%);HBGAs结合位点I附近的V256I(28.5%)、I373 V(8.7%)和N386S(6.5%);抗原表位D附近的T399 V(5.4%)以及N区/S区的A7S1位氨基酸(23%)和N78S(14.2%)替换率较高(图5D)。GⅡ.P16 RdRp区的氨基酸位点变化趋于保守,变异的位点主要分布在H123T(12.3%)、V125A(14.4%)和A360T(10.1%)(图5E)。

2.4.3GⅡ.4 Sydeny[P31] 抗原表位分析显示,GⅡ.4 Sydney[P31]的氨基酸变化主要分布在A表位,分别为H297R(39%)、N372D(45.9%)、N373H(47.1%)。其他表位也存在变化,分别为B表位的M333V(43.6%);D表位的G393S位(29.8%);E表位的P414H(29.8%)和H表位的S309N(39%)(图5F、G)。GII.4 Sydney[P31]在RdRp区氨基酸趋于保守,变异位点主要有15个,其中V179I(38%)、V274I(30%)和K357R(28.5%)替代率较高(图5H)。

3 讨论

根据先前的研究,我国NoV暴发报告主要集中在东南沿海地区[6]。我国东南沿海地区冬季温度、相对湿度有助于诺如病毒的流行。其次,报告疫情最多的省份,广东、浙江、江苏和福建等省份,其高人口密度,也影响了NoV流行的强度。海南同属我国沿海省份,本研究填补了海南NoV暴发监测的空白。与北半球其他国家的研究类似,我国NoV暴发的高峰主要发生在10月至次年3月[7]。本研究与先前报道相一致,暴发主要集中10至次年3月。

根据本研究,海南省NoV暴发主要发生在学校和托幼机构,在我国其他地区也观察到了类似的结果[8]。但在西方国家NoV暴发报告主要来自医疗机构,如长期护理机构和医院[9]。我国对老年人的护理主要由家庭成员提供,老年人去长期护理机构并不是普遍现象;相反,西方国家长期护理机构很普遍。其次,我国和其他西方国家在监测系统的敏感性和覆盖面方面存在重大差异。在美国,除长期护理机构外,其他机构的疫情报告没有法律规定,因此这些机构的疫情报告不足[10]。而我国有完善的学校和托幼机构传染病报告体系,因此,大部分NoV暴发报告来自学校和托幼机构。相对于其他暴发场所如养老院、医院、餐馆等报告少,可能是由于暴发收集的偏差所致。本研究也报告了来自餐点、建筑工地和养老院等场所,提示这些暴发场所也值得关注。

本研究根据不同年龄组及性别进行NoV阳性构成比的比较,2～17岁年龄段与大于55岁年龄段的阳性构成比存在性别差异,前者男性高于女性,后者女性高于男性,可能不同年龄段不同性别行为特征不同,导致在爆发地点的活动范围有所差异而引起的阳性构成比存在性别差异,也可能是爆发场所的群体基础性别存在差异所致。18～40岁年龄段,因爆发场所不同,职业群体存在性别差异,导致NoV阳性检出率不同,托幼机构职业群体多为女性,建筑工地则多为男性,由于本次研究获得这一年龄段阳性数据有限,有待于进一步研究论证。

本研究与国内其他报道一致,引起海南省NoV暴发的基因型是4种最为常见的基因型,包括GⅡ.2[P16]、GⅡ.4 Sydney[P31]、GⅡ.4 Sydney[P16]和GⅡ.3[P12]。GⅡ.4基因型自1995年以来,一直是导致全球流行的基因型。GⅡ.4基因型每隔几年就有新的变异株出现,引起全球新一轮NoV胃肠炎暴发流行。GⅡ.4 Sydney[P31]基因型自 2012 年出现以来一直是全球流行优势株[11-12]。根据美国NoV暴发监测,2015年至2016年,GⅡ.4 Sydney变异株聚合酶基因型从[P31]转变为[P16],之后,欧美国家暴发流行优势株为GⅡ.4 Sydney[P16][5]。而我国处于GⅡ.4 Sydney[P31]和GⅡ.4 Sydney[P16]共流行的状态,海南与我国其他地区报道一致[13]。GⅡ.4基因型主导全球流行的同时,也出现其他基因型造成区域性流行。在2016年,新的重组株GⅡ.2[P16]基因型在我国和亚洲国家出现并引起暴发急剧增加[14-15],但在欧美国家的暴发中不超过 20%[5]。这可能与种族易感性有关,也可能是因为NoV在中国的暴发多发生在学校,而在北美、欧洲和澳大利亚的暴发多发生在医疗机构,包括老年人的长期护理机构[9]。在本研究中也检测到了GⅡ.3基因型引起的暴发。GⅡ.3型NoV是检测到的第二常见基因型,与引起所有年龄段人群AGE的GⅡ.4型NoV不同,GⅡ.3 基因型主要导致5岁以下儿童的AGE,提示可能具有持续的终身保护[16]。

根据基因组进化分析,引起海南NoV暴发的主要流行株GⅡ.[P16]与引起我国16/17年暴发增加的GⅡ.2[P16]仍然同属一簇,提示GⅡ.2[P16]自16年出现以来,仍然处于主导地位。根据氨基酸变异位点分析, 氨基酸变异变化不大。目前,RdRp区功能研究尚不清楚,还需要更进一步的研究探明不同结构蛋白区域突变的表型,以更好理解它们与传播性和大流行影响的联系。

本研究开展的时间正值新冠肺炎疫情流行和防控期间,根据研究报道,非药物干预措施,限制社交距离和采取个人防护措施都通过减少与病原体的接触有效遏制了疾病的传播,如NoV[17]。但有研究预测,若解除接触限制,NoV引起的爆发疫情可能会回升至新冠肺炎疫情前的水平甚至有可能超过原先水平[18]。海南省将通过对NoV爆发持续监测以不断完善相关的研究数据,及时了解本省NoV暴发的分子流行病学特征及流行株基因组变异规律,对今后海南省NoV疫情防控策略的加强与调整提供科学依据。