板栗花提取物体外抑菌效果研究

孙永科,杨林富,杨亮宇,毕保良,初晓辉,杨玉艾

(云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明650201)

长期和广泛的使用抗生素不仅造成病原微生物产生耐药性,并且还带来毒副作用、污染环境以及影响畜产品品质等诸多弊端[1]。中草药具有较好的防治疫病的效果,并具有成本低,残留少,毒副作用小等优点[2],运用中草药进行防治疾病有相当大的潜力。板栗花为壳斗科(Fagceae)栗属植物栗(Castanea mollissima Blume)的雄性花序[3],可以增强血管张力,降低血管脆性,改善血管通透性,降低血脂及胆固醇;减少红血球和血小板聚集,减少血栓的形成[4];护肝解毒,提高机体免疫力;抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制肿瘤[5]等。近年来,随着板栗种植面积的扩大,板栗雄花日益增多,成为板栗生产中的废弃物,造成极大的资源浪费。本试验通过板栗花提取物的体外抑菌试验,进一步明确板栗花的抑菌活性,以期能够变废为宝,为云南省板栗花的进一步研究与开发应用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 板栗花 采自云南省昆明市嵩明县板栗园。

1.1.2 供试菌株 大肠埃希菌O4、大肠埃希菌O8、大肠埃希菌O101、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等均由云南农业大学动物科学技术学院微生物实验室保存。

1.1.3 供试菌株培养基、含药平板和药敏片 由本研究小组参照常规方法[7]制备。

1.2 方法

1.2.1 中药板栗花提取物的制备 采用水提取法提取,称取150 g板栗花细粉,加入5倍～6倍量蒸馏水,浸泡18 h后,煎煮1.5 h～2 h,过滤收集药液,药渣加3倍～4倍量蒸馏水煎煮1.5 h～2 h,再过滤收集药液,最后,药渣再加3倍～4倍量蒸馏水煎煮1 h,过滤收集药液。将三次滤液合并进行浓缩,至其生药量为1 g/mL时,于121℃灭菌15 min～20 min后备用[6]。

1.2.2 营养肉汤培养基和营养琼脂培养基的制备根据常规方法[7]制备。

1.2.3 含药平板的制备 在普通琼脂培养基中加入终浓度分别为:C1=0.001 g/mL C2=0.01 g/mL C3=0.1 g/mL C4=1 g/mL的板栗花提取物。制备方法同1.2.2。

1.2.4 药敏片的制备

1.2.4.1 药敏试纸的准备 用打孔机将常用的定性滤纸打成直径为0.5 cm的圆形滤纸片,121℃灭菌20 min,烘干后备用。

1.2.4.2 药液的准备 将浓缩后的板栗花提取物分别用灭菌蒸馏水稀释成C1=0.002 g/mL、C2=0.02 g/mL、C3=0.2 g/mL、C4=0.5 g/mL 4个浓度。

1.2.4.3 药敏片的制备 将10片药敏试纸放入0.5 mL的药液中,待药液充分吸收后置于37℃～40℃恒温箱中干燥,密封后4℃保存。所得4种浓度的药敏片分别为C1=0.000 1 g/mL、C2=0.001 g/mL、C3=0.01 g/mL和C4=0.025 g/mL。1.2.5 细菌悬液的制备及细菌平板计数 将供试菌株接种于营养肉汤培养基[8]中,37℃培养18 h～24 h后,按10倍稀释制备的10—4、10—5、10—6悬液,分别吸取0.1 mL分别滴入固体培养基中,均匀涂布后于37℃培养18 h～24 h[9],观察并记录结果。

1.2.6 药敏试验

1.2.6.1 含药平板药敏试验 根据平板计数结果,取最适浓度菌液0.1 mL滴入不同梯度含药平板中,均匀涂布后于37℃培养18 h～24 h,观察细菌生长情况。有细菌生长判为阴性,记为“—”;无细菌生长判为阳性,记为“+”。

1.2.6.2 药敏片药敏试验 根据平板计数结果,取最适浓度的菌液0.1 mL滴入制备好的琼脂培养基中,均匀涂布,然后贴上不同梯度的药敏片,每个梯度5片,3个重复,于37℃培养18 h～24 h后,测量药敏片抑菌圈大小。抑菌圈直径＜10 mm为低度敏感,10 mm＜抑菌圈直径为＜15 mm为中度敏感,抑菌圈直径＞15 mm为高度敏感[10]。

2 结果

2.1 最适制作含菌平板的菌液浓度

根据细菌平板计数的结果,确定本试验中各种供试菌的最佳浓度,大肠埃希菌O4为10—3个/mL,大肠埃希菌O8、大肠埃希菌O101、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌均为10—4个/mL。

2.2 含药平板药敏试验结果

不同浓度的板栗花平板抑菌显示,空白和C1=0.001 g/mL浓度的平板对所有试验菌株没有抑制作用,C2=0.01 g/mL、C3=0.1 g/mL和C4=1 g/mL均有明显的抑菌作用。结果如表1。

表1 含药平板抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of the medicated plate

2.3 药敏片药敏试验结果

不同梯度的药敏片对不同受试菌的抑菌圈大小显示,C3=0.01 g/mL和C4=0.025 g/mL两种浓度对大肠埃希菌O4、大肠埃希菌O8、大肠埃希菌O101、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌都高度敏感(结果见表2)。

表2 药敏片抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of sensitive tablets

3 讨论

中草药是我国医药领域的天然宝库,也是世界药品资源的重要组成部分。近年来,因为化学药物和抗生素的过量使用,引起药物残留和细菌耐药性问题日益严重,而中草药作为一种天然药物,有巨大的开发潜力[11]。但是我国兽用中草药的开发相对落后,难以找到让人满意的新药,因此,应加强对民间常用药物的关注,以求开发出更新更有效的抗菌药物。

从本试验研究结果看出,板栗花提取物的浓缩液对细菌的抑制效果明显,被抑制的细菌中既有革兰阳性菌,也有革兰阴性菌;既有球菌也有杆菌,说明板栗花提取物对细菌具有广泛抑制作用。

从药敏试验结果可看出,较低浓度的板栗花提取物即可抑制细菌的生长,大部分细菌对板栗花提取物较低浓度(0.01 g/mL)即表现为高度敏感,证明板栗花提取物具有较好的抑菌作用。

对于药物残留和细菌耐药性问题,除开发研究新的低残留的抗菌药物外,更应控制和杜绝滥用抗生素的现象。抗生素的滥用不仅促使了一些耐药和变异的超级细菌的产生,增加了不良反应的发生几率,并且造成了资源浪费[12]。可以从合理用药,规范兽药市场,加强市场监督管理,提高兽医人员的业务素质等方面改善和减少兽用抗生素的滥用。

查寻相关资料没有发现板栗花不良反应的报道,板栗花在机体内抑菌作用和配伍禁忌有待于进一步研究。

从药敏试验结果可看出,大部分的大肠埃希菌对板栗花提取物较低浓度(0.01 g/mL)即表现为高度敏感,在民间兽医临床上应用40 g/头～80 g/头板栗花对大肠埃希菌引起的仔猪腹泻进行临床治疗,效果比较理想,这也为本课题的下一步的进行指明了方向。

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[5] 王 嗣,唐文照,丁杏苞.板栗花中两个新黄酮苷类化合物[J].药学学报,2004,39(6):442-444.

[6] 杨林富,项 勋,段纲等.中草药黄荆提取物体外抑菌试验[J].黑龙江畜牧兽医,2005(9):69-69.

[7] 刘旭川,张文鑫,李 梅,等.动物微生物实验指导[M].云南昆明:云南农业大学,2001:4-6.

[8] 陆承平.兽医微生物学[M].3版.北京:中国农业出版社,2001:200-203.

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[12] 邱家学,李 娜.浅析我国抗生素滥用现状及危害[J].上海医药,2006,12(27):555-556.