AML1/ETO+融合基因阳性的AML患者骨髓细胞形态学分析

王 平,彭贤贵,陈幸华,刘思恒,张 曦,孔佩艳

(第三军医大学新桥医院血液科,重庆400037)

白血病是造血干细胞突变所致的克隆性恶性肿瘤,染色体分析可以揭示其克隆标志,细胞遗传学较细胞形态学和免疫学表型更能反映白血病的生物学特征。半数以上急性白血病患者可检出克隆性染色体异常,其中,特异性染色体重排与特定的白血病亚型相关。细胞遗传学改变是影响白血病预后的因素[1-2]。急性髓细胞白血病(AM L)部分成熟型的M2b亚型是中国学者于20世纪50年代末提出的,具有髓外浸润率高、治疗反应好、完全缓解率高、缓解期长等特点。其特异性遗传标志为8号与21号染色体的长臂在二区二带断裂并相互移位[t(8;21)(q22;q22)],AM L1基因重排可作为诊断本病的分子标志[3]。作者在工作中时常发现运用荧光原位杂交技术(FISH)方法检测的AM L1/ETO融合基因阳性的病例检测到异形中幼粒细胞多少不一,但形态学上符合M2b诊断的病例却很少。2007年10月至2009年4月本院对收治的66例AML患者进行FISH检测AML1/ETO融合基因,对骨髓形态学特点及AM L1/ETO阳性结果分析,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年10月至2009年4月本院进行AML1/ETO检测的 AM L患者 66例,其中男37例,女 29例,年龄6～64岁,中位年龄46岁。

1.2 形态学 (1)取材:于髂后上棘抽取骨髓液先涂片5～8张用于形态学及细胞化学染色,再抽取1～2 mL用肝素抗凝,用于FISH融合基因检查。(2)涂片染色:取2张干燥、涂片满意的骨髓片用瑞氏染液染色10～15 min,油镜计数200个有核细胞,计算各种有核细胞的构成比。对染色不满意的骨髓片另取1张重新染色。(3)分型标准:将核浆发育明显不平衡、胞质中出现中性颗粒、有核仁的细胞划入“异常中幼粒细胞”,见彩插Ⅱ图1。AM L形态学分型标准采用国内分型标准[4]。

1.3 FISH AM L1/ETO融合基因检测 (1)探针:采用英国Cytocell公司双融合 AM L1/ETO探针,光谱橘红直接标记ETO和光谱绿色直接标记AML1。(2)方法:厂商提供的操作方法略加修改,简述如下:①1～2 mL肝素抗凝骨髓血2 500 r/min离心8 min去上清液,加8 mL 0.075 M KCl 30 min;②1 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)吹打混匀1 800 r/min离心8 min去上清液;③6 mL固定液,吹打混匀1 800 r/min离心8 min去上清液,重复 2～3次;④样本制备、滴片;⑤2×SSC,70%、85%、100%乙醇各2 min;⑥10 μ L探针,18×18盖玻片,封片胶封片;⑦杂交仪:变性72℃2 min,杂交37℃至少16 h;⑧去盖玻片,0.3 NP40、0.4 SSC 72 ℃2 min,0.1 NP40、2 SSC 37℃30 s;⑨10 μ L DAPⅡ加盖玻片暗视野荧光显微镜观察。(3)结果判断:用配有DAPI/FITC/TRITC三色激发块的O-lympus BX51荧光显微镜检查杂交信号,用Olympus PM30显微照相机进行照相。正常间期细胞出现2橘红2绿色分散荧光信号,出现2黄色1橘红1绿色信号为AM L1/ETO阳性细胞,每个样本观察500个间期细胞并观察中期分裂相。

表1 66例AM L形态学诊断及AM L1/ETO[t(8;21)(q22;22)]融合基因结果

2 结 果

2.1 形态学 66例AML骨髓细胞形态学分型结果见表1。在AM L1/ETO融合基因阳性病例中,首次化疗完全缓解(CR)率 78.4%(9例AML-M2a、8例 AM L-M2b及 1例 MDSRAEB-Ⅱ),4例AML-M2a 2次化疗CR,1例 AML-M2a 5次化疗仍NR。

2.2 FISH AML1/ETO融合基因检测结果 见彩插Ⅱ图2、表2。光谱橘红标记ETO和光谱绿色标记AML1信号明晰,正常间期细胞2橘红2绿色分散荧光信号,AM L1/ETO阳性细胞2黄色1橘红1绿色信号。

表2 AM L1/ETO+融合基因与异形中幼粒细胞比例构成

3 讨 论

AM L1/ETO融合基因主要见于白血病M2b亚型,M2b与国际上的[t(8;21)]M2是同一亚型,其特异性遗传标志为8号与21号染色体的长臂在二区二带断裂并相互移位[t(8;21)(q22;q22)],形成AML1/ETO融合基因[5]。急性髓系白血病的其他亚型如M1、M4、MDS-RAEB-1等也有少数病例表达此融合基因[6-8]。本组形态学诊断 AML-M 2b病例均表达AM L1/ETO融合基因(阳性率71%～95%),部分AML-M2a、MDS-RAEB亦表达AML1/ETO融合基因(阳性率27%～94%)。回顾分析AM L1/ETO阳性病例骨髓涂片,都能检测到异形中幼粒细胞(表2)。AML1/ETO[t(8;21)(q22;q22)]融合基因改变一定伴随异形中幼粒细胞表达,但异形中幼粒细胞与融合基因表达也有不一致性。本组融合基因阳性率(27%～95%)明显高于异形中幼粒细胞比例(4.5%～71.5%),基因表达先于骨髓形态表现。

本研究发现在临床中形态学诊断AML-M2b明显低于AML1/ETO融合基因检测阳性率,AM L-M2b临床诊断明显较低,其原因可能:(1)AML-M2b主要由形态学界定,其原始粒细胞明显诊断,以异形中幼粒细胞增生为主并比例大于30%[7];(2)国内外报道急性髓细胞白血病其他亚型如M1、M4、M5等少数病例也表达 AML1/ETO融合基因[6-8]。在这部分病例可能伴有复杂核型,[t(8;21)(q22;q22)]不占主导作用;(3)AM L1/ETO融合基因产生一种嵌合蛋白,作为主要的抑制物改变了正常AM L1-CBF(核结合因子)β这种与造血干细胞分化有关的转录复合物的生理功能[5]。部分AM L-M2a、RAEB-Ⅱ,虽然检测到异形中幼粒细胞但比例小于30%,可能不同白血病细胞分化程度的不同,部分病例可能为疾病较早期;(4)在M2b形态诊断中异形中幼粒细胞辨认至关重要,不同观察者标准有所不同。综合张之楠、杨崇礼等[6,9]对异形中幼粒细胞描述,本文将核浆发育明显不平衡、胞质中可见中性颗粒、有核仁的细胞划入“异常中幼粒细胞”。

目前一般认为AML1/ETO阳性是预后良好的指标之一,但也有报道预后中等。刘旭辉等[10]报道一个疗程化疗的CR率(80.6%)高。国内有报道复杂核型的[t(8;21)(q22;q22)]复杂异位的急性髓质白血病的实验研究,在常规临床治疗中DA化疗敏感差[11]。在本组AM L1/ETO融合基因阳性病例中,首次化疗 CR率达 78.4%,9例 M 2a、8例 M2b及1例MDS-RAEB-Ⅱ首次化疗CR,4例M2a 2次化疗CR,1例M2a 5次化疗仍NR。出现异形中幼粒细胞比例高的M2b首次缓解率明显高于其他的AM L/ETO+AM L。AM L1/ETO融合基因产生的融合蛋白与造血干细胞分化有关的转录复合物的生理功能[5],异形中幼粒细胞表达的此类物质与化疗作用相关。目前还未见异形中幼粒细胞与化疗敏感度有关的报道,由于病例总数较少、时间较短,还需要进一步观察与总结。

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