格列卫联合三氧化二砷对 K562细胞 Caspase-3和Bcl-xL mRNA表达影响的研究

陈乃耀,王大力,张 江,汪 静

研究已证实化疗药物可以使白血病细胞的恶性增殖受到抑制,加速细胞的凋亡,而且在分子水平上可以出现凋亡相关基因的改变[1-2]。现以 K562细胞为研究对象,检测格列卫

(STI571)单药及 STI571与三氧化二砷 (As2O3)联合应用对白血病细胞某些生物学特性及与 BCR/ABL融合基因下游信号通路有关的凋亡相关因子 Caspase-3和 Bcl-xL mRNA表达的影响,以探明两药抗白血病细胞作用的可能的分子机制,为临床治疗白血病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 K562细胞 (中国医学科学院血液病研究所),RPMI1640培养基 (美国 GIBICO公司),Trizol(美国invitrogen公司),AMV反转录试剂盒 (上海生工生物技术有限公司),AnnexinV/PI检测试剂盒 (晶美生物工程公司),STI571(诺华公司),As2O3(哈尔滨伊达药业有限公司),焦碳酸二乙酯 (DEPC)原液 (中国医学科学院血液研究所),超净工作台 (青岛海尔医用低温科技有限公司),Line-gene荧光定量、PCR检测系统 (杭州博日科技有限公司)等。

1.2 方法步骤 (1)配制 RPMI1640培养基、100×双抗、DEPC原液、四甲基噻唑蓝 (MTT)溶液等。 (2)K562细胞的复苏、冻存。(3)分组:对照组为未用药物处理的 K562悬浮培养组;实验 1组 (EG1组)为单用 1μmol/L STI571处理组,实验 2组 (EG2组)为 1μmol/L STI571与 2μmol/L As2O3处理组。(4)实验前 24 h,2×106/ml的 K562细胞换用无血清的 RPMI1640培养基培养,使细胞同步化。(5)实验开始时结束同步化,用含 10%胎牛血清 (FBS)的 RPMI1640培养基,按照上述药物浓度向细胞悬液中加入药物,反复吹打混匀。在 37℃、5%二氧化碳 (CO2)、饱和湿度的条件下培养 24 h。室温下 1 000 r/min离心 5 min,弃上清,收集 K562细胞,进行总 RNA的提取。用紫外分光光度计行 RNA纯度测定,即测定 RNA光密度 (OD),满足 OD260值 /OD280值为 1.6。(6)参照试剂盒说明书将总 RNA进行反转录,合成 cDNA。(7)PCR反应。引物设计:应用 Primer premier 5生物设计软件分别设计出 Caspase-3、Bcl-xL及 β-actin的上游引物及下游引物。Caspase-3:上游 5′-TTTTTCAGA GGGGATCGT TG-3′, 下游 5′-CGG CCT CCA CTG GTA TTT TA-3′, 扩增产物为 151 bp。Bcl-xL:上游 5′-GTA AAC TGG GGT CGC ATT GT-3′, 下游 5′-TGC TGC ATT GTT CCC ATA GA-3′,扩增产物为 198 bp。β-actin:上游 5′-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3′,下游 5′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3′,扩增产物为 205 bp。3组引物均由上海生工生物科技有限公司合成,按照说明,在 200μl无酶 EP管中加入 2×Sybr Mix、PCR Forward Primer等成分,构成反应体系。

1.3 结果评定 目的基因的数量用相对定量的方法来表示,内参基因 β-actin的数量需进行标准化。先分别获得对照组和实验组目的基因、内参基因的 CT值。ΔCT(1)=(实验组目的基因 CT值 -实验组内参基因 CT值);ΔCT(2)=(对照组目的基因 CT值 -对照组内参基因 CT值);ΔΔCT=ΔCT(1)-ΔCT(2)。需要分析的实验组目的基因相对于对照组目的基因的量用 2-ΔΔCT求得。实验重复 3次,取平均值,绘制2-ΔΔCT值的直方图 。

1.4 统计学方法 实验数据以 (x±s)表示,采用 SPSS 13.0统计软件进行数据处理。两组计量资料的比较用 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与对照组 〔Bcl-xL mRNA的表达为 (0.75±0.08)〕相比,EG1组、EG2组 Bcl-xLmRNA的表达减少,且减少程度EG2组 ＞EG1组,差异有统计学意义 (P＜0.05)。与对照组〔Caspase-3 mRNA表达为 (0.96±0.05)〕相比,EG1组、EG2组 Caspase-3 mRNA的表达增加,且增加程度 EG2组 ＞EG1组,差异有统计学意义 (P＜0.05,见表 1)。

表 1 实验组 K562细胞 Bcl-xL mRNA和 Caspase-3 mRNA的表达(x±s)Table 1 The 2-ΔΔCT value of Bcl-XL and Caspase-3 mRNA of K562 cells in EG1 and EG2 groups

3 讨论

在我国慢性粒细胞白血病 (CML)占白血病的 20%,病死率极高,且缺乏有效的治疗手段[3-4]。随着对 CML发病机制研究的不断深入,CML的治疗也已经到了针对 BCR/ABL基因的分子水平。研究发现,在慢性期的治疗中 STI571有显著的疗效,大多数患者的急性变将被延迟若干年,但对于急变期患者来说 STI571的疗效降低,这可能与耐药的产生有关[5]。正是由于 STI571在治疗中存在的不足,引起了人们对其他靶点药物的关注,As2O3便是治疗 CML的新型靶点药物之一,于是 STI571与 As2O3联合应用的方法开始被学者关注,两药共同作用可能涉及的分子机制目前尚未阐明。

为了进一步证实这两种药物在分子水平上的作用,采用目前较新的实时荧光定量 PCR方法来检测凋亡相关基因的表达情况。本研究以凋亡相关基因 Caspases家族和 Bcl-2家族中的重要成员 Caspase-3、Bcl-xL为研究对象,是因为它们与CML的发病相关,受 BCR/ABL下游多种信号转导途径的影响[6-7],且它们之间可以相互制约,都是在线粒体水平上发挥作用,与 STI571及 As2O3的作用机制相关联。通过实时荧光定量 PCR方法检测对照组及 EG1组、EG2组 K562细胞Caspase-3、Bcl-xL mRNA的表达,发现单用 STI571与STI571联合 As2O3应用相比较,后者使 Bcl-xL mRNA表达下降更明显,而 Caspase-3 mRNA表达增加更明显,且这种差异有统计学意义。提示 As2O3增强 STI571抗白血病细胞作用的分子机制可能是通过使抗凋亡基因 Bcl-xL表达减少和促凋亡基因 Caspase-3表达增多而实现的。而且在实验条件下,较低浓度的 As2O3与 STI571在较短时间就可出现这种抗白血病细胞的作用。由此我们推测 As2O3可能是通过其线粒体途径直接激活 Caspase-3,并且通过阻断 BCR/ABL的恶性信号转导,下调 Bcl-xL间接地活化 Caspase-3,这样也就使得STI571下调 Bcl-xL,最终激活 Caspase-3而诱导细胞凋亡的作用加强;正是由于药物在根本上使得这两种基因的表达发生了变化,所以得到了宏观上光密度值及凋亡率的相应变化。

总之,本研究选择 STI571及 As2O3作为干预措施来研究K562细胞的变化,发现了药物对细胞的增殖及凋亡的作用,并且从基因水平得到了证实,这对于 CML的临床治疗特别是终末期的治疗具有重要的指导意义;与 As2O3联用,可以作为STI571克服自身不足及提高其疗效的一种方法,为临床治疗CML提供了新的思路。

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3 Wertheim JA,Miller JP,Xu L,et al.The biology of chronic myelogenous leukemia:mouse models and cell adhesion[J].Oncogene,2002,21(56):8612-8628.

4 Thievle J,Kvasnicka HM,Schmitt-Graeff A,et al.Bone marrow histopathology predicting blast crisis in chronic myeloid leukemia[J].Acta Haematol,2001,105(4):244-246.

5 Fang G,Kim CN,Perkins CL,et al.CGP57148B(STI571)induces differentiation and apoptosis and sensitizes Bcr-Abl-positive human leukemia cells to apoptosis due to antileukemic drugs[J].Blood,2000,96(6):2246-2253.

6 Johansson B,Fioretos T,Mitelman F.Cytogenetic and molecular genetic evolution of chronic myeloid leukemia[J].Acta Haematol,2002,107(2):76-94.

7 Soto-Cerrato V,Llagostera E,Montaner B,et al.Mitochondriamediated apoptosis operating irrespective of multidrug resistance in breast cancer cells by the anticancer agent prodigiosin[J].Biochemical Pharmacol,2004,68(7):1345-1352.