神经干细胞相关研究进展

方 庆 陈新生

（安徽医科大学附属安庆医院神经外科，安徽 安庆 246003）

神经干细胞相关研究进展

方 庆 陈新生

（安徽医科大学附属安庆医院神经外科，安徽 安庆 246003）

神经干细胞

1992年Reynolds等首次报道了从成鼠脑纹状体中分离出能够在体外增值并且具有向神经元及胶质细胞分化潜能的神经干细胞。近年来，神经干细胞的研究及应用对目前迅速发展的生命科学产生了巨大的影响，神经干细胞能够促进神经元细胞的再生及脑组织的修复，并且可以应用于神经系统的基因治疗，表达神经营养因子、代谢酶及神经递质，为神经系统疾病的治疗提供了新的有效途径。本文就神经干细胞的最新研究进展和应用作一综述。

1 神经干细胞的概念

神经干细胞（NSC）是干细胞的一种，是存在于脑和脊髓中的未分化细胞，同其他干细胞一样，神经干细胞也具有分裂增殖和多样分化的特点，具有自我更新能力，它能够分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种类型的神经组织细胞，它属于专能干细胞。1989年Anderson等首次提出了神经干细胞的概念，随后Reynolds和Cattaneo等分别报道了NSC的发现及NSC的特性。2000年Gage[1]将神经干细胞概括为可生成神经组织或者来源于神经系统的具有自我更新能力并且能够通过不对称细胞分裂产生的新细胞。

2 神经干细胞的来源及分布

2.1 胚胎神经干细胞

中枢神经系统神经干细胞来源于囊胚期内细胞群，至少分为神经球干细胞和神经上皮干细胞两类，前者依赖于表皮生长因子（EGF）发育分化，后者依赖于成纤维生长因子（FGF）发育分化[2]。1981年Evans等首次在实验中从小鼠囊胚中得到了第1个哺乳动物来源的胚胎神经干细胞。Thomson等[3]在1998年从体外受精的多余囊胚中建立了人胚胎神经干细胞系。哺乳动物的胚胎脑中神经干细胞主要分布于以下7个部位：脑室下带、海马、嗅球、脊髓、小脑、侧脑室脑（室管膜上皮）和大脑皮质。研究认为不同部位的神经干细胞可能分别属于不同的干细胞群体，并非同一类干细胞分布在不同的位置，所以脑的正常发育不仅取决胚胎神经干细胞增值与分化，而且还取决于胚胎神经干细胞哪些细胞会发生程序性死亡或者凋亡[4]。

2.2 成体神经干细胞

成体神经干细胞专指分布于胚胎、成人中枢神经系统及周围神经系统中干细胞。主要存在于脑室区、脑室下区、海马、纹状体、嗅球、脊髓等部位，在所有的成体哺乳动物脑内有两个高密度的细胞分化区，即脑室下区和海马齿状回的粒下区。由于成体神经干细胞可以来源患者本人，通过体外扩增后再移植回患者本人的脑组织，所以可以避免免疫排斥，有可能解决限制神经干细胞应用的免疫排斥及伦理道德方面的难题[5]。但是由于从成人神经系统提取成体神经干细胞手术风险高，此类细胞也存在于胎儿的脑中[6]，所以实验和临床应用中均是在利用流产胎儿的胎脑中提取成体神经干细胞。田增民等[7,8]在研究中将取自于胎儿胎脑的成体神经干细胞移植入小脑萎缩及帕金森症的患者脑中取得良好的效果，患者神经系统功能障碍得到明显改善。

2.3 间充质神经干细胞

由于间充质细胞具有分化成为间质起源的任意组织的潜能[9-12]，这使得间充质干细胞成为神经干细胞研究的一个新的热点。由于间充质干细胞取材范围广，并且可以取自自体组织，所以解决了免疫排斥和伦理道德的问题，成为组织工程中的神经干细胞的最佳选择。间充质干细胞分布广泛，不仅存在于骨髓中，还可以从外周血、肌肉组织、牙齿组织、大脑及脐带血、胎儿器官中分离得到[13,14]，并且有报道从脐带静脉内皮下及羊水中也能分离得到间充质干细胞分化为神经干细胞[15,16]。Jeong等[17]发现将从脐带血中分离得到的间充质干细胞在特定培养基中培养后，能够迅速分化成为神经元细胞及神经胶质细胞。很多实验已经证实由间充质神经干细胞移植后能够明显改善神经系统的功能[18]。Bliss等认为间充质神经干细胞移植后改善神经系统功能的机制可能是分泌出神经营养因子增强神经系统的修复机制而不是替代损伤的神经组织[19]。

3 神经干细胞的生物学特性

神经干细胞具有强大的增值分裂能力，它的主要生物学特性包括：①自我更新能力：神经干细胞具有自我更新和高度增值的能力，一定的条件下能够进行有丝分裂。有丝分裂分为两类即对称分裂和不对称分裂。②多分化潜能：神经干细胞能够分化成为神经元细胞、少突胶质细胞及星形胶质细胞。③迁徙能力：在神经系统的发育过程中，神经干细胞不断的进行迁徙，并且受到病变部位神经源性信号的影响，参与神经结构和功能的修复。④良好的组织相容性：研究中发现移植的神经干细胞能够通过血脑屏障，在脑组织中与宿主细胞在结构功能上形成良好的整合。⑤可以被转染并稳定的表达外源性基因。⑥可以分离出单个细胞克隆。

4 神经干细胞的培养与鉴定

4.1 神经干细胞的培养

目前多数神经干细胞的培养采用无血清细胞培养和细胞克隆技术进行分离。在培养液中添加胰岛素、黄体酮、腐胺、谷酰胺、转铁蛋白及具有丝裂原作用的生长因子。神经干细胞目前最基本的两种培养方式是悬浮培养和单层贴壁培养，Reynold等大部分学者主要采用悬浮培养的方式来培养神经干细胞。以此种方式培养的神经干细胞在培养基中以神经球的方式生长，有研究表明在琼脂糖抗贴壁培养瓶中以悬浮培养的方式培养神经干细胞有利于神经干细胞的持续增殖，提示琼脂糖抗贴壁培养适合神经干细胞的大量扩增[20]。但是此种方法培养神经干细胞的时候，随着神经球的增长，营养物质和氧气渗入减少并且代谢废物排除受阻，内部较易出现凋亡、坏死，甚至出现神经球中空的情况。Gage等[21]在研究中曾采用单层贴壁的方式培养神经干细胞，此种方法不存在营养物质交换困难的问题，但是细胞只能向二维生长，不能提供组织正常生长发育所需要的环境条件，然而环境条件对细胞的基因表达和生物学行为起着相当重要的作用，所以单层细胞培养所反映的生物学特性，与体内组织细胞相差较大。近年来，很多研究者采用具有三维结构的支架材料来进行神经干细胞的培养取得了良好的效果[22]，支架材料为细胞提供结构支撑，提供与体内组织更加相似的细胞生长微环境，利于组织的生成[23]。

4.2 神经干细胞的鉴定

目前，对于神经干细胞的鉴定主要有形态观察和标志物检测，但是最准确的方法还是标志物的检测。光镜下神经干细胞的形态学有如下特点：①未分化的干细胞主要以两种形式存在：一种是散在生长分布的神经干细胞，细胞大而圆且呈良好的活力状态。另一种是形成神经球的神经干细胞，呈岛屿状存活，边缘清楚，表面光滑，结构致密，隆起生长，组成细胞球的细胞圆润饱满呈较佳活力状态。②不同部位来源的神经干细胞的生长特性不同。③神经干细胞的核型分析。目前神经干细胞的标志物检测最常用的是神经元中间丝蛋白，包括巢蛋白（nestin）和神经元RNA结合蛋白Musashil。其次，角质细胞标志物（GFAP）、vimentin、CD133等也有应用，另外神经元NeuN、抗神经元特异性标记物β-tubulin-Ⅲ、5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）等也常用于神经干细胞的荧光鉴定。

5 神经干细胞分化的影响因素

研究表明，神经干细胞的分化由外源性因素（细胞因子）和内源性因素（基因）共同调控，其中内源性因素起着决定作用。

5.1 外源性因素

神经干细胞分化的外源性因素主要包括：①生长因子（如FGF2、EGF、BDNF、NT3、LIF等[24]），目前研究认为碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）和表皮生长因子（EGF）等在神经干细胞的分化中起着最重要的作用，其他生长因子主要起到协同作用；②微环境：包括神经干细胞附近的神经细胞、胶质细胞和细胞外基质成分等。有研究发现星形胶质细胞与神经干细胞共同培养时，神经干细胞分化速度明显加快，提示星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元细胞分化[25]。另外有实验发现许多神经递质如甘氨酸、肾上腺素、GABA、乙酰胆碱等也参与神经干细胞的分化的调节。

5.2 内源性因素

研究表明，神经干细胞分化的多样性可能与转录因子有关。不同的转录因子促进神经干细胞向不同的谱系分化。神经干细胞的基因调控包括正性调节和负性调节。正性调节是通过不对称分裂使神经干细胞分化，其中bHLH转录因子包括NeuroD、Mash1和Math家族等[26]，bHLH基因主要调节神经元及神经胶质细胞的选择，如错误表达，可使分化的神经元细胞减少，但是对神经胶质细胞的分化无影响[27]。负性调节则是通过对称性分裂增加神经干细胞的数量，但是使神经干细胞不分化，主要包括Notch信号等途径，与bHLH的作用相反，Notch的作用主要是抑制神经干细胞向神经元方向分化，促进神经干细胞向胶质细胞方向分化。

6 神经干细胞的应用研究

神经干细胞的应用目前已经在神经系统损伤、神经系统肿瘤、坏死性疾病等方面开展了治疗研究。目前神经干细细的研究主要通过以下途径：①将神经干细胞体外扩增移植到病损部位；②将生长因子导入神经干细胞，组织神经细胞的变性坏死；③诱导内源性神经干细胞的激活、增殖来促进损伤神经的修复。Hideyuk等[28]在研究中将小鼠胚胎神经干细胞移植入成鼠脊髓挫伤区后，小鼠的运动功能有所改善。田增民等[8]应用人胚胎神经干细胞植入帕金森患者的纹状体，取得良好效果。

7 问题与展望

神经干细胞的发现为中枢神经性的重建和神经的再生提供了一个新的思路，打破了传统观念所认为的中枢神经系统损伤后不能再生，只能由星形胶质细胞增生，瘢痕组织代替缺失的神经元。但是目前神经干细胞的研究中还有很多问题亟待解决，如定向诱导分化是目前神经干细胞应用于临床的一个关键问题，我们还很难得到来源于同一谱系，分化程度一致，细胞无异质性的神经干细胞[29]；神经干细胞移植后显效慢，移植后患者脑内瘤样团块的形成，伦理上的争议都是目前制约神经干细胞临床应用的问题。

[1] Gage HF.Mammalian neural stem cells[J].Science,2000,287(5457): 1433-1438.

[2] Garcia-Verdugo JM,Ferron S,Flames N,et al.The proliferative ventricular zone in adult vertebrates:a comparative study using reptiles,birds,and mammals[J].Brain Res Bull,2002,57(6):765-775.

[3] Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282 (5391):1145-1147.

[4] Zhang Q,Qin H,Lang B,et al.Different regions of the mouse nestin enhancer may function differentially in nestin expression in an NSC-like cell line and astrocytes[J].Neurosci Lett,2005,379(2):90-95.

[5] Peterson DA.Stem cells in brain plasticity and repair[J].Curr Opin Pharmacol,2002,2(1):34-42.

[6] Terskikh AV,Bryant PJ,Schwartz PH.Mammalian stem cells[J]. Pediatr Res,2006,59(4 Pt 2):13-20.

[7] 田增民,李志超,尹丰等.人神经干细胞移植治疗小脑萎缩[J].第二军医大学学报,2004,25(9):933-935.

[8] 田增民,刘爽,李士月等.人神经干细胞临床移植治疗帕金森[J].第二军医大学学报,2003,24(9):957-959.

[9] Snyder EY,Daley GQ,Goodell M.Taking stock and planning for the next decade:realistic prospects for stem cell therapies for the nervous system[J].J Neurosci Res,2004,76(2):157-168.

[10] Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke[J].Stroke,2007,38(2 Suppl):817-826.

[11] Boyle AJ,Schulman SP,Hare JM,et al.Is stem cell therapy ready for patients?Stem Cell Therapy for Cardiac Repair.Ready for the Next Step[J].Circulation,2006,114(4):339-352.

[12] Vddndnen HK.Mesenchymal stem cells[J].Ann Med,2005,37(7): 469-479.

[13] Wislet-Gendebien S,Hans G,Leprince P,et al.Plasticity of cultured mesenchymal stem cells:switch from nestin-positive to excitable neuron-like phenotype[J].Stem Cells,2005,23(3):392-402.

[14] 尹国才,陈新生,郑爱芳等.人胎脑神经干细胞在发育期脑脊液中的迁移和分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(1): 24-27.

[15] Romanov YA,Svintsitskaya VA,Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSC-like cells from umbilical cord[J].Stem Cells,2003,21(1):105-110.

[16] 冯建勋,腊晓林,马 艳等.SD大鼠羊水间充质干细胞向神经样细胞体外诱导分化[J].世界华人消化杂志,2010,18(3):250-255.

[17] Jeong JA,Gang EJ,Hong SH,et al.Rapid neural differentiation ofhuman cord blood-derived mesenchymal stem cells[J].Neuroreport, 2004,15(11):1731-1734.

[18] Satake K,Lou J,Lenke LG.Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue[J].Spine, 2004,29(18):1971-1979.

[19] Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke[J].Stroke,2007,38(2 Suppl):817-826.

[20] 郑学胜,刘伟国,杨小锋.一种新的神经干细胞抗贴壁培养方法[J].解剖学报,2006,37(2): 236-239.

[21] Gage FH.Stem cells of the central nervous system[J].Curr Opin Neurobiol,1998,8(5):671-676.

[22] Irons HR,Cullen DK,Shapiro NP,et al.Three-dimensional neural constructs:a novel platform for neurophysiological investigation [J].J Neural Eng,2008,5(3):333-341.

[23] Nakajima M,Ishimuro T,Kato K,et al.Combinatorial protein display for the cell-based screening of biomaterials that direct neural stem cell differenitiation[J].Biomaterials,2007,28(6): 1048-1060.

[24] 尹国才,栾佐,闫凤青等.LIF对人胎脑神经干细胞在体外增殖和分化的影响[J].中国免疫学杂志,2005,21(6):449-454.

[25] Zhou YF,Fang F,Fu JR.An experimental study on astrocytes promoting production ofneural stem cells derived from mouse embryonic stem cells[J].ChinMed J (Engl),2005,118(23): 1994-1999.

[26] Seo S,Richardson GA,Krollk I.The SWI/SNF chromatin remodeling protein Brg1 is required for vertebrate neurogenesis and mediates transactivation of Ngn and NeuroD[J].Development, 2005,132(1):105-115.

[27] Allan DW,Park D,St Pierre SE,et al.Regulators acting in combinatorial codes also act independently in single differentiating neurons[J].Neuron,2005,45(5):689-700.

[28] Hideyukio.Neural stem cells as therapeutic agents for CNS injuries and disorders[J].Int Congress Series,2003,1252:493-498.

[29] 王忠诚.神经干细胞在中枢神经系统损伤修复中的应用前景[J].中国康复理论与实践,2004,10(1):1.

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