MK和MMP-26在人乳腺组织中的表达及临床意义

王玉欣 马英智 孙 梅

(武警吉林省总队医院病理科，吉林 长春 130052)

中期生长因子(Midkine，MK)能调节细胞生长、存活和分化，在人类多种恶性肿瘤中表达增强〔1，2〕。MK在乳腺癌肿瘤组织中的表达无论是表达频率还是表达程度均明显高于癌旁正常组织〔3，4〕。MK的高表达程度与预后不良密切相关。基质金属蛋白酶(MMP)-26在肿瘤侵袭和转移中起重要作用〔5〕。本文旨在研究这两种基因在乳腺癌发生、发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源 所有乳腺癌组织及正常乳腺组织均取自2005年12月至2008年6月吉林大学第二医院住院患者，共计92例。其中浸润性乳腺导管癌63例，乳腺原位癌7例，乳腺增生14例，正常乳腺组织8例，取自因良性疾病行乳腺切除，及因乳腺良性肿瘤活检病理回报为正常乳腺组织。所有标本均经严格筛选及2名以上病理医生进行病理诊断。标本固定于10%甲醛固定液中，经取材、脱水、透明、浸蜡、包埋后切片，切片厚为4μm。烤干后备用。

1.2 方法 免疫组织化学染色步骤:(1)组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水;(2)0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次5 min;(3)枸橼酸盐修复重复步骤(2);(4)过氧化物酶阻断15 min(A液)，重复步骤(2);(5)非免疫动物血清(B液)30 min;(6)以0.01 mol/L PBS稀释一抗(1∶100)，直接滴加于切片上，30μl/片，4℃过夜后，重复步骤(2)，阴性对照以PBS替代一抗;已知的阳性片作对照。(7)加生物素标记物的二抗(C液)30 min，重复步骤(2);(8)滴加链霉亲和素-过氧化物酶溶液(D液)30 min后，重复步骤(2);(9)二氨基联苯胺(DAB)发色，水洗终止;(10)苏木精复染细胞核，常规脱水透明，中性树脂封片。

结果判定:以胞质和胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。根据染色范围和强度界定蛋白的表达，阳性范围记分:＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分;染色强度计分:不染色为0分，弱染色1分，中度染色2分，强染色3分。表达最终得分=染色范围×染色强度，最终得分≥4分为免疫反应阳性(+)，＜4分为免疫反应阴性(-)。

1.3 统计学处理 应用SPSS14.0统计软件，根据实验数据资料类型进行χ2检验和Spearman等级相关分析等检验。

2 结果

2.1 MK在乳腺组织中的表达 MK蛋白阳性表达在正常乳腺组织〔1(12.5%)〕与乳腺增生〔2(14.3%)〕没有明显差别(P＞0.05)，而与原位癌〔3(42.5%)〕和浸润性导管癌〔36(57.1%)〕中的表达有显著性差异(P＜0.05)。乳腺增生中MK阳性表达与原位癌和乳腺浸润性导管癌差异显著(P＜0.05)。原位癌和乳腺浸润性导管癌中MK阳性表达没有显著性差异(P＞0.05)。

2.2 MMP-26蛋白在乳腺组织中的表达 MMP-26阳性蛋白在正常乳腺组织〔1(12.5%)〕与乳腺增生〔3(21.4%)〕中表达没有明显差别(P＞0.05)，而与原位癌〔4(57.1%)〕和浸润性导管癌〔34(54%)〕有显著性差异(P＜0.05)。乳腺增生中MMP-26阳性表达与原位癌和乳腺浸润性导管癌差异显著(P＜0.05)。原位癌和乳腺浸润性导管癌中的MMP-26表达没有显著性差异(P＞0.05)。

2.3 MK、MMP-26在人浸润性乳腺组织中的表达与部分临床指标的关系 MK、MMP-26阳性表达与肿瘤大小、组织学分级无关(P＞0.05)，但与淋巴结转移密切相关，MK、MMP-26表达阳性患者淋巴结转移率明显高于阴性表达的患者(P＜0.05)。见表1。

2.4 MK蛋白表达与MMP-26表达的相关性分析 MK与MMP-26蛋白在乳腺癌组织中表达呈正相关。见表2。

表1 MK、MMP-26在乳腺癌组织中表达与临床参数间的关系

表2 MK、MMP-26在乳腺癌组织中表达的相关性(n)

3 讨论

MK在多种恶性肿瘤组织和癌前病变中高表达，而在正常组织和良性肿瘤中低表达或不表达〔1〕，并与肿瘤患者的预后密切相关。本文通过对人乳腺癌组织的免疫化学染色检测MK蛋白在不同乳腺组织中的表达，结果显示MK在乳腺原位癌组织和浸润性导管癌中呈高表达，而在乳腺良性增生性病变和正常组织低表达。与以往的研究报道相一致〔6〕，无论是表达频率还是表达程度，乳腺癌肿瘤组织均明显高于正常癌旁组织。Trojan等〔7〕采用DNA微阵列技术研究发现MK基因与前列腺癌的转移有关。在宫颈癌中，Moon等〔8〕用竞争PCR和免疫组化方法发现宫颈癌组织中MK mRNA和蛋白的表达均高于正常对照组，而且其程度与肿瘤大小和临床分期有关。过高的MK表达在神经母细胞瘤中也提示预后不良〔9〕。Huang等〔10〕研究发现胃癌组织中的MK表达高，并与肿瘤TNM分期及远处转移呈正相关，进一步提示MK在肿瘤转移过程中的作用。已有报道MK在乳腺癌中的表达与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关〔4，6〕。本实验结果表明MK的高表达与淋巴结转移呈正相关，但与肿瘤大小和组织学分级无关。

MMP-26与肿瘤的侵袭和转移密切相关。本文同时检测了MMP-26蛋白在不同乳腺组织中的表达，结果表明MMP-26在乳腺原位癌和浸润性导管癌中呈高表达，并与肿瘤的淋巴结转移密切相关。已有报道MMP-26在前列腺癌、肺癌、乳腺癌组织中高表达〔11，12〕。Konishi等〔1〕等检测了 MMP-26 蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达，并分析了其与部分临床指标的关系，结果显示MMP-26的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期密切相关，因此推测MMP-26可能在肿瘤细胞的转移过程中发挥重要作用。

本文还发现在乳腺癌组织中MK蛋白表达与MMP-26表达呈正相关，推断这两种基因在乳腺癌发展中相互促进。因此联合检测MK和MMP-26蛋白在乳腺癌组织中的表达可以作为判断肿瘤恶性程度、侵袭能力的指标，并进而判断预后。

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6 谢 平，陆永良，姚 行，等.中期因子和微血管密度在乳腺癌中的表达〔J〕.中华实验外科杂志，2004;21(1):92-3.

7 Trojan L，Schaaf A，Steidler A，et al.Identification of metastasis associated genes in prostate cancer by genetic profiling of human prostate cancer cell lines〔J〕.Anticancer Res，2005;25(1):183-91.

8 Moon HS，Park WI，Sung SH，et al.Immunohistochemical and quantitative competitive PCR analyses of midkine and pleiotrophin expression in cervical cancer〔J〕.Gynecol Oncol，2003;88(3):289-97.

9 Ikematsu S，Nakagawara A，Nakamura Y，et al.Correlation of elevated level of blood midkine with poor prognostic factors of human neuroblastomas〔J〕.Br JCancer，2003;88(10):1522-6.

10 Huang Y，Cao G，Wang H，et al.The expression and location of midkine in gastric carcinomas of Chinese patients〔J〕.Cell Mol Immunol，2007;4(2):135-40.

11 Isaka K，Nishi H，Nakai H，et al.Matrix metalloproteinase-26 is expressed in human endometrium but not in endometrial carcinoma〔J〕.Cancer，2003;97(1):79-89.

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