褪黑素对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶亚型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影响

刘明远 杨光远 王跃新 张春斌 白 雪 张建华

(佳木斯大学药理学教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

褪黑素(Melatonin，MT)，是由哺乳动物和人松果体分泌的一种胺类激素，主要经细胞色素(CY)P1A2和CYP2C19代谢，具有镇静催眠、抗应激、抗衰老、增强免疫、抗肿瘤等作用〔1～3〕。明确MT对CYP450酶各亚型的影响，对了解其与临床其他药物的相互作用、指导临床合理用药具有重要的意义。关于MT对肝微粒体酶活性影响的研究，国内外文献鲜见报道。本课题组前期实验结果表明，MT对大鼠CYP450含量和CYP1A2、CYP2C19活性无影响。本研究应用甲苯磺丁脲、异喹胍和咪达唑仑为CYP450同工酶选择性探针底物，进一步观察MT对大鼠肝微粒体CYP450酶亚型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的诱导和/或抑制作用，为临床用药及相关实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar大鼠，清洁级，体重180～250 g〔购自佳木斯大学实验动物中心，合格证号:SYXK(黑)2006-004〕。

1.1.2 主要试剂与仪器 MT(含量＞98%，多多药业有限公司);甲苯磺丁脲、4'-羟基甲苯磺丁脲、异喹胍、4'-羟基异喹胍、咪达唑仑、1'-羟基咪达唑仑(Sigma公司);Aligent 6310质谱仪、Agilent 1200高效液相色谱系统(美国Agilent公司);752型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 给药方案 健康Wistar大鼠24只，雄性，随机分成三组，每组8只。对照组，灌胃给予生理盐水，连续给药7 d;MT给药组，每日灌胃给予MT(0.54 mg/kg)，连续给药7 d;苯巴比妥诱导组，自MT给药组给药的第5天开始每日腹腔注射苯巴比妥钠75 mg/kg，连续给药3 d。

1.2.2 肝微粒体的制备 动物拉颈椎处死，取出肝脏，立即放于冰冷的0.25 mol/L蔗糖溶液(pH7.4)中清洗，剪碎，清洗至无血色;取肝重2 g，加1 ml蔗糖溶液，在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆;4℃20 000 r/min离心20 min，上清液100 000 r/min离心60 min，沉淀用0.1 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)悬浮均匀，保存于－80℃。

1.2.3 蛋白浓度测定 依据Lowry等方法〔4〕测定。取牛血清白蛋白标准溶液，与铜试剂、Folin phenol试剂反应后，测750 nm吸收度，以蛋白浓度C对吸收度A进行线性回归得标准曲线。肝微粒体样品用0.5 mol/L NaOH稀释适当倍数后同法操作，根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.2.4 CYP2C9活性测定 选择甲苯磺丁脲作为特异性底物，参照文献方法，建立孵化体系及定量测定4'-羟基甲苯磺丁脲的分析方法〔5，6〕。孵化体系中含大鼠肝微粒体蛋白1.0 mg/ml、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)1.0 mmol/L、MgCl210.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L、甲苯磺丁脲 30.0 μmol/L，以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)定容至500μl，孵化体系中甲醇的终浓度为0.06%，孵化10 min，取样100μl，加入到200μl冰冷的甲醇中终止反应。样品处理后，高效液相色谱串联质谱分析。

1.2.5 CYP2D6活性测定 选择异喹胍作为其特异性底物，参照文献方法建立定量测定4'-羟基异喹胍的分析方法〔7〕，孵化体系同1.2.4，异喹胍浓度为50μmol/L，孵化体系中甲醇的终浓度为0.1%。样品处理后，高效液相色谱串联质谱分析。

1.2.6 CYP3A4活性测定 选择咪达唑仑作为其特异性底物，参照文献方法建立定量测定1'-羟基咪达唑仑的分析方法〔8〕，孵化体系同1.2.4，咪达唑仑浓度为100 μmol/L，孵化体系中甲醇的终浓度为1%。样品经处理后，高效液相色谱串联质谱分析。

1.3 统计学分析 使用SPSS17.0统计软件，数据资料采用x±s表示，组间比较用t检验。

2 结果

以各探针药物的代谢产物的产率 (nmol·mg protein－1·min－1)作为酶活性指标。MT给药组和对照组大鼠肝微粒体CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性见表1。两组间比较无统计学差异(P ＞0.05)，说明MT对CYP2C9、CYP2D6、CXP3A4亚型活性没有抑制或诱导作用。

表1 对照组、MT组 CYP2C9、CYP2D6及CYP3A4 活性(nmol·mg protein－1·min－1，x±s)

3 讨论

MT是一种由松果体分泌的神经激素，具有调节睡眠的作用，分泌规律呈夜峰昼谷。青春期后，分泌量随年龄增长而逐渐下降〔9〕。到中老年时期，体内分泌的MT水平明显下降，从而使大多数中老年人倍受失眠之苦。失眠症是临床上一种常见的疾病，如果得不到有效地控制，可进一步发展为重度抑郁症〔10〕。在改善睡眠方面，MT呈现明显的优势，至今，仍有很多人选择MT改善睡眠质量。

药物代谢性相互作用是指同时或先后序贯使用2种或2种以上药物时，因代谢环节的影响导致疗效增强或降低。多种药物合用时，代谢性相互作用发生率高达药物相互作用的40%，具有非常重要的临床意义。代谢性药物相互作用最常见的原因是CYP450的诱导和抑制。由于老年人除失眠外常合并其他躯体疾病，MT与其他药物合用在老年人中较为常见。因此，研究MT对肝微粒体CYP450酶的影响具有十分重要的意义。CYP450酶根据其氨基酸序列不同分为不同亚型，人体主要有5 种CYP450 酶，即CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9 和CYP2C19。这5种CYP450酶可以代谢约99%的通过CYP450酶代谢的药物〔11〕。本课题组前期实验结果表明，MT对大鼠CYP1A2、CYP2C19活性无影响。为了更全面掌握 MT对CYP450酶的作用，本实验进一步探讨了 MT对肝微粒体CYP450酶CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影响，为临床安全联合用药提供理论依据。

本试验以0.54 mg/kg体重(相当于人体推荐用量)剂量的MT原料药连续给大鼠灌胃 7 d，测定MT直接给药对大鼠CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影响。结果显示:Wistar大鼠经过MT处理后，与对照组比较，CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性均没有变化，提示当MT与某些主要经CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4代谢的药物合用时，发生代谢性药物相互作用的可能性较小。

利用探针药物测定催化特定底物的CYP450酶活性，可用于分析和比较不同个体中酶活性的差异，为临床安全合理用药提供科学依据〔12〕。本实验分别以甲苯磺丁脲、异喹胍、咪达唑仑为CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的特异性底物，通过代谢产物的生成速度来评价酶的活性。高效液相色谱-质谱联用技术检测灵敏度高、选择性好，在药物分析领域应用广泛，本试验采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定4'-羟基甲苯磺丁脲、4'-羟基异喹胍和1'-羟基咪达唑仑含量，快速、灵敏、简便。

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12 朱立勤，娄建石.细胞色素P450与药物代谢的研究现状〔J〕.中国临床药理学与治疗学，2004;9(10):1081-4.