不同血清浓度及体外培养时间对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态学的影响

董 萍 杨永鹏 丁克祥 刘 敏 罗迎霞 丁 宇 左夏林 韩晋云 杨方应 丁振华

(大连市董萍医疗美容整形医院美容整形外科，辽宁 大连 116011)

皮肤成纤维细胞是目前研究真皮层乃至整体皮肤老化改变较为重要和敏感的细胞系。Crowston等〔1〕发现，用人体血清培养的人肌腱成纤维细胞凋亡数量减少、增殖旺盛、生长状态良好。然而，血清中除含有成纤维细胞生存和生长所需基本营养成分和细胞生长因子外，还含有某些细胞毒因子和抗体及酶类等。因此，成纤维细胞体外培养面临着选取何种血清浓度和介质及培养时间才能使其获得更好的生存状态、更高的生长活力等问题。本课题组曾报道〔2〕不同血清浓度和介质对体外培养小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态的影响，但在不同血清浓度、不同培养时间的条件下对体外培养成纤维细胞生存和生长影响的实验研究却报道较少。为此，本文选择小鼠成纤维细胞L929细胞系，观察细胞生长周期和细胞形态学以了解不同血清浓度及体外培养时间对成纤维细胞生存和生长状况的影响，为探索成纤维细胞体外培养提供最佳微环境条件提供一定的参考和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 小鼠成纤维细胞L929细胞系，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 主要试剂及配制 新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品;RPMI1640培养基，Hyclone公司产品;磷酸盐缓冲剂(PBS)，北京鼎国生物技术有限责任公司产品;乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶，上海生物工程有限公司产品;三氯乙酸(TCA)，天津市科密欧化学试剂有限公司产品;磺基罗丹明B(SRB)，购自Sigma-Aldrich公司;吖啶橙染液(AO)，购自Sigma公司;苏木素-伊红(HE)染液，购自中杉金桥试剂公司;醋酸，天津市化学试剂三厂产品;Tris碱，长沙鹏程生物公司产品;多聚甲醛，太阳生物公司产品;氨水，广东光华化学有限公司产品;盐酸，湖南省株洲市化学工业研究所产品;乙醇，天津市大茂化学试剂厂产品。

1.1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱，德国Heraeus公司产品;超净工作台，Heal force，上海申力科学仪器产品;BIO-RAD 550酶标仪，BioRad公司产品;OLYMPUS倒置显微镜、OLYMPUS BX-60荧光显微镜，日本奥林巴斯公司产品;R200D电子天平，德国Storius公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠成纤维细胞L929细胞系培养 小鼠成纤维细胞L929细胞系用含10%新生牛血清的 RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养;待细胞达汇成片后，0.25%EDTA胰酶消化培养瓶细胞，血细胞板计数并制成细胞悬液;分别以2 500/孔接种于96孔细胞培养板，以10 000/孔接种于24孔细胞培养板。

1.2.2 分组 将贴壁后细胞按生长时间分组为:2、4、6、8 d组;按培养液中血清浓度分组为:0%组、20%组、40%组、60%组、80%组、100%组，各浓度设7个平行。按照配方配制各组培养液，见表1。

表1 不同浓度血清培养液具体配制方案

1.2.3 SRB法检测细胞生长 96孔板细胞贴壁3～4 h后，弃掉10%新生牛血清培养液;按实验分组每孔加入200μl含不同浓度血清的RPMI1640培养液;37℃，5%CO2恒温培养箱中分别培养2、4、6、8 d，并取细胞培养板检测。弃掉培养液，PBS冲洗1～2次，每孔加入100μl 10%TCA，4℃固定1 h;弃掉TCA，去离子水冲洗3～5遍，干燥。每孔加入100μl 0.2%SRB染液，室温下染色30 min;弃掉染液，用1%醋酸洗掉未结合的染液，干燥。每孔加入200μl pH10.5的10 mmol/L非缓冲Tris碱液，置摇床低速振荡20 min。在酶标仪A490波长下测量各孔的吸光值(OD值)，记录分析。

1.2.4 HE染色 HE染细胞核着紫蓝色，使细胞质中的成分着淡红色。①干预:24孔板细胞贴壁3～4 h后，弃掉10%新生牛血清培养液;按实验分组每孔加入400μl含不同浓度血清的RPMI1640培养液;37℃，5%CO2恒温培养箱中分别培养2、4、6、8 d，并取细胞培养板检测。②固定:弃掉培养液，PBS冲洗，每孔加入200μl 4%多聚甲醛，室温固定20 min，弃掉固定液，PBS冲洗。③染色:HE染色5 min，吸掉染液，流水洗掉未结合的HE染液。④分化:1%盐酸乙醇瞬间分化，流水稍微冲洗。⑤返蓝:5%氨水返蓝5 s，流水冲洗。⑥ 复染:HE染液复染20 min，吸掉染液，蒸馏水洗掉未结合的染液。⑦ 拍照:倒置显微镜下200倍拍照。

1.2.5 AO染色 吖啶橙与细胞核内DNA结合呈绿色荧光，与细胞质内RNA结合呈橘红色荧光。①24孔板细胞贴壁3～4 h后，弃掉10%新生牛血清培养液;按实验分组每孔加入400μl含不同浓度血清的RPMI1640培养液;②37℃，5%CO2恒温培养箱中分别培养2、4、6、8 d，并取细胞培养板检测弃掉培养液，PBS冲洗，避光，每孔加入200μl吖啶橙染液，摇床振荡染色5 min。③去染液，PBS冲洗2次，摇床振荡，每次5 min。④吸尽液体，荧光显微镜下蓝光激发200倍拍照。

2 结果

2.1 细胞形态学实验结果 见图1。

2.1.1 HE染色 在同一生长时间下，无血清组细胞变圆、核固缩，很多细胞核呈现不规则形状且被深染，仅存几个细胞形态正常。随着血清浓度的升高，细胞形态恢复正常，但100%血清浓度组细胞凋亡现象较为严重，细胞变圆、凋亡核固缩比较明显。随着生长时间的增加，各20%、40%、60%血清组细胞数量呈现增加趋势，细胞形态也大多正常;80%血清组细胞出现空泡化现象，100%血清组细胞空泡化现象非常严重。

2.1.2 AO染色 在同一培养时间下，无血清组细胞大部分核固缩为半月形，极少数保持原有细胞形态且质中有RNA的存在;而随着血清浓度的增加，细胞形态恢复较快，固缩半月形细胞核的比例也很快减少，质中RNA的存在也表明细胞大部分处于增殖生长的阶段;而高浓度血清组细胞的形态发生改变，凋亡细胞核固缩比例增加，很多细胞核呈亮染半月形。随着生长时间的增加，细胞在大量增殖的同时，由染色图片可看出，细胞形态开始发生不规则改变，大量细胞亮染、核固缩并出现凋亡小体。

图1 不同血清浓度、不同生长时间AO和HE染色细胞形态(×200)

2.2 SRB法测定细胞生长曲线实验结果

2.2.1 血清浓度对细胞生长的影响 20%组和40%组细胞可以正常生长，随着血清浓度的增加，特别是血清浓度达到60%及以上，对细胞生长产生明显的抑制作用。其中，0%组OD值明显低于其他浓度组，可见0%组对细胞生长有较强的抑制作用;而20%组相对于0%组而言，OD值呈现快速增加趋势，对细胞促进作用较强;20%组和40%组OD值没有明显的趋势变化，此间血清浓度变化对细胞的生长影响不是太大。此后，在相同的培养时间下，随着血清浓度的升高，SRB法测定细胞的OD值逐渐减小，对细胞生长具有抑制作用，尤其是100%血清组抑制作用较为明显。见图2。

2.2.2 生长时间对细胞生长的影响 在适当的培养时间内，随着细胞生长时间的延长，除0%组OD值无明显变化只呈现微弱的降低趋势外，其余浓度组OD值一直处于增加状态;各浓度组OD值在4 d之内增加迅速，细胞生长较快;生长时间在4～6 d时，OD值增加趋势较弱;6～8 d时，增加趋势又有所增强;其中，100%组OD值在此期间(4～6 d)增加趋势非常明显，细胞生长很快。见图3。

图2 血清浓度对细胞生长影响柱形图

图3 生长时间对细胞生长影响柱形图

3 讨论

皮肤衰老是随着年龄增长而发生的皮肤生理性衰老，与真皮成纤维细胞减少、衰老密切相关〔3〕。成纤维细胞是普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞，细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，其基本功能是合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和葡聚糖、糖蛋白等细胞外基质成分和细胞因子，同时在伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。异体真皮衍生物(dermalogen)、透明质酸、微粒化异体真皮(alloderm)等在临床中的应用皆存在各种问题的出现，从而限制了其发展。

血清中含有丰富的氨基酸、肽类、蛋白质、核酸及其关联物质、糖类、脂类、微量元素、某些维生素及其他有机物，这些物质是细胞生存和生长所需微环境的重要条件之一。而血清中的多种生长因子，包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子、神经生长性因子等能够特异性与目的细胞膜上受体结合，并通过细胞信号传导通路促进和加快细胞的增殖及生长代谢及相关因子的表达。例如，碱性成纤维细胞生长因子就是一类能促进来源于中胚层和神经外胚层细胞有丝分裂并诱导其分化的多肽生长因子。除此之外，一些微量元素和离子，如Zn、Se、Mn、Ge等，可作为某些重要酶的辅基在代谢解毒及抗氧化等方面起重要作用。正是由于血清具有这些多样性的生物学特性，使其越来越多地应用于多种细胞的体外培养，例如成纤维细胞、软骨细胞等。血清多样性的生物学特点可以促进中胚层细胞(包括成纤维细胞、血管内皮细胞等)分裂增殖，同时促进新生细胞和有活力细胞的数量不断增多，不断产生胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸、皮肤素等成分。虽然血清富含营养成分，具有丰富的生物学特性，但是如何使体外培养条件达到体内环境的标准仍然是目前所面临的问题。原因在于血清成分和生物学作用复杂，血清浓度过小时促贴壁和扩展因子、黏附因子、结合蛋白等物质缺失〔4〕，从而造成细胞衰老、细胞附着性降低、细胞核裂解空泡化或胞质颗粒变性等;而血清浓度过大可能会造成成纤维细胞体外培养所需营养不足，且其含有的细胞毒性物质和抑制物质对细胞有去分化作用，可能影响某些细胞功能的表达。Ojeh等〔5〕认为成纤维细胞在100 ml/L血清浓度培养基中生长良好，但刘鹏等〔6〕人认为猪和鼠的成纤维细胞在这种培养基中状态不良，易老化，不能取得令人满意的效果。与此同时，成纤维细胞的倍增时间较短，一般3～4 d可传一代，但除了在不同血清浓度下同一生长时间成纤维细胞生长情况不同外，在相同血清浓度下、不同生长时间下，成纤维细胞生长情况也不同。

本实验在不同血清浓度(0%，20%，40%，60%，80%，100%)及不同生长时间(2，4，6，8 d)条件下，比较体外培养小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态，结果可见在相同生长时间下，0%组对细胞生长有较强的抑制作用，20%、40%对细胞均有较强促进作用;而当血清浓度超过60%，SRB法测定细胞的OD值逐渐减小，对细胞生长具有抑制作用，尤其是100%血清组抑制作用较为明显。进一步发现，无血清组(0%)几乎无正常形态细胞，20%、40%、60%的血清浓度中，细胞形态逐渐恢复正常;而超过60%的血清浓度会造成细胞凋亡。而随着生长时间的增加，各浓度组OD值在4 d之内增加迅速，细胞生长较快。高浓度的血清组可见细胞凋亡。本实验结果说明，如果从血清浓度和细胞生长时间等综合因素考虑，当血清浓度为20%、40%、60%，细胞生长时间为2～4 d时，成纤维细胞体外培养环境较佳。因此，在利用血清进行成纤维细胞体外培养时，应充分考虑血清浓度和细胞生长时间对细胞生长和形态的影响。

然而，本实验尚未对细胞培养后培养液中血清蛋白、细胞因子、无机元素和pH值等进行测定，因此，目前尚未知成纤维细胞培养过程中产生的代谢产物或表达产物释放到细胞培养液后是否会引起其pH值、血清浓度及其他成分变化。特别是，此阶段的实验研究尚未知成纤维细胞培养过程中是否出现其代谢产物或表达产物的改变，如是否会影响到成纤维细胞通过摄取所需的氨基酸、在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链、多肽链输送到高尔基复合体后组成前胶原分子、前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外等生物学过程，而这个过程是否出现不同胶原蛋白亚型及其比值的改变，将是下一步深入探索和研究的内容和方向。

1 Crowston JG，Wang XY，Khaw PT，et al.Human serum reduces mitomycin-C cytotoxicity in human tenon's fibroblasts〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006;47(3):946-52.

2 杨永鹏，董 萍，丁克祥，等.不同血清浓度及介质对体外培养小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态的影响〔J〕.国际老年医学杂志，2010;31(6):241-9.

3 McCullough JL，Kelly KM.Prevention and treatment of skin aging〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2006;10(1067):323-31.

4 刘 苹，李 平，周元国，等.血清浓度对TGF-β1刺激成纤维细胞增殖的影响〔J〕.西南军医，2008;10(5):1-3.

5 Ojeh NO，Frame JD，Navsaria HA.In vitro characterization of an artificial dermal scaff old〔J〕.Tissue Eng，2001;7(4):457-9.

6 刘 鹏，金 岩，刘 源，等.不同种属真皮成纤维细胞在不同血清浓度培养基中生长的比较观察〔J〕.实用口腔医学杂志，2004;20(1):16-9.