灵芝孢子粉对重症急性胰腺炎大鼠免疫功能的调整作用

蔡文辉，王亚贤，杨景云

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154002)

重症急性胰腺炎(SAP)是一种发病机理复杂、治疗难度大的危急重症，至今其治疗效果在临床上仍不够理想。此时，肠道免疫功能和整体免疫功能均处于抑制状态，继而肠道屏障被破坏，导致细菌易位［1］、内毒素血症［2］的发生，对机体可造成二次打击，这已成为80%SAP患者的直接死因。所以，提高免疫功能对于SAP的治疗是非常重要的。本实验旨在探讨灵芝孢子粉对SAP患者出现的免疫功能低下的调整作用，以减少其并发症，提高治愈率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选择成年SD大鼠70只，雌雄各半，体质量为220g～280g，由佳木斯大学动物中心提供。

1.1.2 药物与试剂 牛磺胆酸钠(美国Sigma公司);奥曲肽(印度太阳药业有限公司);灵芝孢子粉(上海康舟真菌多糖有限公司);淀粉酶(AMS)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);白细胞介素－2(IL－2)放免药盒(北京福瑞生物工程公司);分泌型IgA(sI-gA)免疫放射试剂测定盒(北京福瑞生物工程公司)。

1.1.3 主要仪器 γ(珈玛)免疫计数器(型号:XH－6020，中国核工业总公司西安二六二厂);多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);760CRT双光束紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);显微镜(日本)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 70只大鼠随机分为五组，每组14只。其中，Ⅰ组为假手术组，Ⅱ组为SAP模型组(简称模型组)，Ⅲ组为奥曲肽治疗组(简称奥曲肽组)，Ⅳ组为灵芝孢子粉治疗组(简称灵芝组)，Ⅴ组为灵芝孢子粉和奥曲肽联合治疗组(简称奥灵联合组)。各组均严格按照具体要求制备相应模型［2］。

1.2.2 给药方法 根据各组的不同情况进行给药［2］。

1.2.3 血清淀粉酶(AMS)含量的检测 各组大鼠于术后6h、12h、24h 分别检测 AMS 含量［2］。

1.2.4 肠黏膜sIgA含量的检测 根据实验条件，将大鼠断髓后，切取回肠末端，冷生理盐水冲洗肠腔，取肠粘膜，称取0.5g，加生理盐水 0.5ml，匀浆后4℃冷藏过夜，3 000rpm低温离心10min，取上清检测。采用免疫放射法(双抗体夹心法)，严格按照说明书操作步骤进行操作。

1.2.5 血清中IL－2含量的检测 将大鼠浅麻醉后，从其内眦静脉处取血，3 000rpm离心15min后，取血清检测。采用放免法按说明书中的测定方法进行操作。

1.2.6 吞噬细胞的吞噬功能检测 在各组大鼠处死前，由尾静脉注入印度墨汁(用生理盐水稀释5倍)10ml/kg，于注射后2、7min 分别从眼眶取血20μl，加到2ml 0.1%碳酸钠中摇匀，2h后用紫外分光光度计(λ=680nm)测定其吸光度值，按下列公式计算吞噬率K值:K=(logOD1－logOD2)/(t2－t1)。

1.2.7 胰腺组织病理学检查 取出动物胰腺组织，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色后，用光镜观察。

2 结果

2.1 AMS含量的检测结果

2.1.1 模型组与假手术组AMS的定量检测 正常大鼠循环血中含有一定量的淀粉酶，SAP时血清淀粉酶含量显著上升(P＜0.05)，证明重症急性胰腺炎模型制备成功［2］。

2.1.2 各治疗组与模型组AMS的定量检测 结果显示，单用灵芝孢子粉不能及时有效降低血清淀粉酶［2］。

2.2 肠黏膜内sIgA含量的检测结果

2.2.1 模型组与假手术组的检测 结果见表1。

表1 模型组与假手术组肠黏膜内sIgA含量的检测结果比较(±s)

表1 模型组与假手术组肠黏膜内sIgA含量的检测结果比较(±s)

注:与假手术组比较，t=6.792，*P ＜0.05。

n sIgA(ng/ml)14 29.02 ±4.45模型组 8 13.26 ±6.45假手术组*

SAP时肠黏膜内sIgA的含量明显降低，与假手术组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明SAP时肠道免疫功能减弱。

2.2.2 各治疗组与模型组sIgA含量的检测 结果见表2。

表2 各组大鼠肠黏膜内sIgA含量的检测结果比较(±s)

表2 各组大鼠肠黏膜内sIgA含量的检测结果比较(±s)

注:与模型组比较，*P＞0.05;△P＜0.05;与奥曲肽组比较，#P＜0.05;与灵芝组比较，○P ＜0.05。

n sIgA(ng/ml)13.26 ±6.45奥曲肽组 9 13.78 ±3.06*灵芝组 10 18.36 ±3.00△#奥灵联合 12 23.73 ±3.57△#○模型组8

奥曲肽组仅略增加肠黏膜内sIgA的含量，与模型组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，说明奥曲肽在提高肠道免疫功能方面作用极小。灵芝组与奥灵联合组均能在一定程度上增加其含量，与模型组、奥曲肽组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，奥灵联合组比灵芝组效果更好(P＜0.05)，说明灵芝孢子粉具有增强肠道免疫功能的作用。

2.3 IL－2含量的检测结果

2.3.1 模型组与假手术组IL－2含量的检测 结果见表3。

表3 模型组与假手术组IL－2含量的检测结果比较(±s)

表3 模型组与假手术组IL－2含量的检测结果比较(±s)

注:与假手术组比较，t=9.625，*P ＜0.05。

n IL－2(ng/ml)14 2.35 ±0.30模型组 8 1.24 ±0.16假手术组*

SAP大鼠血清中IL－2的含量与假手术组比较明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明SAP时免疫功能减弱。

2.3.2 各治疗组与模型组IL－2含量的检测 结果见表4。

表4 治疗组与模型组IL－2含量的检测结果比较(±s)

表4 治疗组与模型组IL－2含量的检测结果比较(±s)

注:与模型组相比较，*P＞0.05，△P＜0.05;与奥曲肽组比较，#P＜0.05;与灵芝组比较，○P ＞0.05。

n IL－2含量(ng/ml)1.24 ±0.16奥曲肽组 9 1.31 ±0.18*灵芝组 10 1.60 ±0.15△#奥灵联合 12 1.71 ±0.10△#○模型组8

灵芝组、奥灵联合组均可提高IL－2的含量，与模型组、奥曲肽组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，验证了灵芝孢子粉有增强免疫功能的作用。奥灵联合组比灵芝组效果更好，但差异无统计学意义(P＞0.05)。奥曲肽组略提高其含量，差异不显著(P＞0.05)，说明奥曲肽在增强免疫功能方面作用甚小。

2.4 吞噬细胞的碳廓清能力的检测结果

2.4.1 模型组与假手术组碳廓清能力的检测 结果见表5。

表5 模型组与假手术组的吞噬细胞的碳廓清能力的比较(±s)

表5 模型组与假手术组的吞噬细胞的碳廓清能力的比较(±s)

注:与假手术组相比较，t=9.176，*P ＜0.05。

n吞噬率K值14 0.050 5 ±0.005 3模型组 8 0.022 2 ±0.009 3假手术组*

SAP组大鼠的血碳清除率与假手术组比较明显降低，差异显著(P＜0.05)，说明SAP时吞噬细胞的吞噬功能明显减弱。

2.4.2 各治疗组与模型组碳廓清能力的检测 结果见表6。

表6 治疗组与模型组的吞噬细胞的碳廓清能力的比较(±s)

表6 治疗组与模型组的吞噬细胞的碳廓清能力的比较(±s)

注:与模型组比较，*P＞0.05，△P＜0.05;与灵芝组比较，#P＞0.05。

n吞噬率K值0.0222 ±0.0093奥曲肽组 9 0.0286 ±0.0075*灵芝组 10 0.0372 ±0.0075△奥灵联合 12 0.0413 ±0.0062△#模型组8

经灵芝孢子粉治疗后，吞噬细胞的功能大大增强，灵芝组、奥灵联合组与模型组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，说明灵芝孢子粉具有增强吞噬细胞吞噬功能的作用。奥曲肽组与模型组相比，差异不显著(P＞0.05)。奥灵联合组与灵芝组间，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.5 胰腺组织病理学检查结果

SAP模型组胰腺结构不清，点状或局灶性坏死;炎性细胞大量浸润，红细胞渗出极明显，再一次证明模型制备成功。经灵芝孢子粉治疗后，病变减轻。

3 讨论

胆胰管逆行注射牛磺胆酸钠造模法是模拟临床上胆汁返流性胰腺炎的最常用的模型，因其在病因、致病机制及病变等方面与人类临床重症急性胰腺炎相似，且诱发成功率高，有很好的重复性和可比性。本实验采用此法，经检测观察到典型的重症急性胰腺炎特征。免疫功能受到抑制，机体清除局部和全身细菌的能力下降。本实验观察到，SAP模型组吞噬细胞的吞噬功能明显下降(P＜0.05)，IL－2含量和肠黏膜内sIgA的含量均减少，亦证明了此观点。IL－2主要由活化的TH细胞产生，具有促进T细胞增殖、增强杀伤T细胞、NK细胞的活性等广泛的免疫调节作用，也能促进B细胞增殖分化合成相应抗体，激活单核吞噬细胞使之分泌功能和吞噬能力显著增强，是维持正常免疫功能和抵御感染的重要因素，位居免疫调节的中心地位。sIgA是影响肠道免疫功能的最重要的因素，在创伤、烧伤、失血性休克等应激条件下，黏膜固有层中淋巴细胞和上皮内淋巴细胞都明显减少，IgA+浆细胞呈选择性抑制，sIgA也随之减少，导致肠道免疫功能减退，细菌突破肠道屏障的机会就会增加，引起感染。目前，多数学者认为，SAP患者细胞免疫功能低下是其发生感染并发症及死亡率高的原因［2］。

灵芝孢子粉具有广泛的药理作用［3］，本研究应用灵芝孢子粉治疗后，实验动物的免疫功能明显增强，说明灵芝孢子粉在治疗SAP方面有一定的作用。但其不能有效地降低血清淀粉酶含量，所以不宜单用。本研究认为，灵芝孢子粉联合西药治疗SAP可能会有更广阔的前景。

［1］ 蔡文辉，杨景云.灵芝孢子粉对重症急性胰腺炎大鼠肠道微生态失调的调整作用［J］.中国微生态学杂志，2008，20(2):140 －142.

［2］ 蔡文辉，张磊，杨景云.灵芝孢子粉在治疗重症急性胰腺炎方面的作用［J］.浙江中医药大学学报，2009，33(1):50 －52.

［3］ 林志彬，王鹏云.灵芝孢子及其活性成分的药理研究［J］.北京大学学报:医学版，2006，38(5):541 －547.