紫杉醇有关物质检测HPLC法色谱条件优化

北京市朝阳区药品检验所（100028）张艳霞

中国食品药品检定研究院（100050）孙磊

《中国药典》2010年版二部已经收载紫杉醇原料药及制剂的HPLC有关物质检查法[1][2]。由于药典和相关文献[3][4]的色谱条件梯度变化较剧烈，造成紫杉醇主峰流出后的色谱图基线波动较大，影响其后杂质峰的检出和定量，因此笔者优化了色谱条件，并进行了方法学验证，分析时间稍延长，但提供了更好的分离和识别效果。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪（2487紫外检测器，Epower2工作站），岛津2010a高效液相色谱仪（紫外检测器，CLASSVP工作站），紫杉醇、三杉尖宁碱（杂质Ⅰ）和7-表-10-去乙酰基紫杉醇（杂质Ⅱ）对照品均为USP reference standard，乙腈（色谱纯，Fisher），实验用水为Milli-Q系统制备，紫杉醇注射液。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Alltech C18 (250 m m×4.6 m m×5 μm)；检测波长227nm；柱温35℃；流速1.2ml·min-1。乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱程序如下：

2.2 系统适用性试验 取紫杉醇、杂质Ⅰ和杂质Ⅱ对照品适量，用乙腈溶解并稀释制成每1ml含紫杉醇1.2mg、杂质Ⅰ和杂质Ⅱ各6μg的溶液作为系统适用性溶液。取该溶液连续进样6次，进样量15μl，理论板数按紫杉醇峰计应不低于25000，紫杉醇峰与杂质Ⅱ峰的分离度应不低于1.2，杂质Ⅱ峰面积的RSD应不大于2.0%。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液 精密量取注射液2ml置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

附表 梯度洗脱程序

2.3.2 对照溶液 精密量取供试品溶液0.5ml置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 赋形剂溶液 精密量取赋形剂2ml置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 有关物质测定

取系统适用性溶液、对照溶液、供试品溶液和赋性剂溶液各15μl分别注入色谱仪，记录色谱图，60分钟前所记录的色谱图中，扣除赋形剂溶液中的色谱峰，杂质Ⅰ（杂质Ⅰ峰面积乘以校正因子1.26）与其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的4倍（2.0%），见附图。

2.5 专属性试验 对紫杉醇注射液进行酸液（0.1mol/LHCl）、碱液（0.1mol/LNaOH）、氧化（3%H2O2）、高温（80℃水浴加热4.5小时）、光照（日光下直射30分钟）等破坏试验并用上述色谱条件检查，结果表明光破坏、热破坏、氧化破坏后的样品未产生新杂质，酸和碱破坏的样品产生新杂质，各杂质峰分离均良好。

2.6 线性范围、检出限和定量限 精密称取紫杉醇对照品6.06mg，置入10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取该溶液配制成一系列浓度的7份溶液，每份溶液进样2次，进样量15μl。以进样量（ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=1983.632x-5659.408，r=0.9997，表明紫杉醇在1.212～454.5ng范围内呈良好的线性关系。

以信噪比S/N≈3，测得紫杉醇检出限为40ng·ml-1；以信噪比S/N≈10，测得紫杉醇定量限80ng·ml-1。

2.7 稳定性和重复性 照供试品溶液制备法制备溶液1份，取该溶液分别在0h、5h、12h、16h和24h测定，进样量15μl，各杂质峰面积RSD均小于2%，表明供试品溶液稳定性良好；照供试品溶液制备法制备溶液6份，取6份溶液各进样2次，进样量15μl，各杂质峰面积RSD均小于2.5%，表明重复性良好。

3 讨论

流速考察 将流速降低到1.1ml·min-1，其他条件不变，有杂质峰消失；将流速升高到1.3ml·min-1，其他条件不变，杂质峰的数目和分离效果与原先基本一致。因此，流速应在1.2ml·min-1～1.3ml·min-1。

柱温考察 将柱温降至30℃，其他条件不变，有2个杂质峰消失；将柱温升至40℃，其他条件不变，杂质峰的数目与原先基本一致，个别峰分离度更好。因此，柱温应在35℃～40℃。

pH值耐用性 将pH值降低0.2单位，其他条件不变，杂质峰的数目和分离效果与原先基本一致；将pH值升高0.2单位，其他条件不变，杂质峰的数目和分离效果与原先基本一致。因此该方法能够耐受较小的pH值变化。

色谱柱耐用性 另采用AKZO NOBEL Kromosil 100 C18色谱柱及迪马钻石C18色谱柱（均为250 mm×4.6mm×5μm）对同一样品进行了测定，色谱图基本一致，表明该法对色谱柱的耐用性较好。