小型猪特异性麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区Na＋，K＋-ATP酶活性的影响

卢德章，范宏刚，王洪斌，张栾松，马 昆，姜 胜，谭丽娟，于世明

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

Na＋，K＋-ATP酶（又被称为钠泵）普遍存在于各种细胞膜，只有保持此酶的正常活性，才能产生并维持可兴奋细胞的膜电位，以维持神经细胞的兴奋性和传导性［1］。麻醉药可通过对Na＋，K＋-ATP酶活性的抑制，改变细胞膜内外Na＋，K＋、Ca2＋稳态，影响突触兴奋、突触传递和突触的递质释放而产生麻醉作用。小型猪复合麻醉剂-XFM，是依据平衡麻醉理论和小型猪的生理特点研制成功的一种小型猪专用的麻醉剂［2］。为了更好的将XFM在临床上推广应用，保障科研试验后小型猪生理机能快速恢复，东北农业大学小型猪麻醉课题组在XFM的基础上，研制小型猪特异性麻醉颉颃剂，来颉颃XFM的麻醉作用。本研究旨在探讨大鼠在XFM麻醉下被小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒时大脑各脑区Na＋，K＋-ATP酶的变化，拟从离子ATP酶方面揭示小型猪特异性麻醉颉颃剂的催醒作用的分子学机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料 XFM和小型猪特异性麻醉颉颃剂由东北农业大学动物医学学院外科教研室配制，超微量Na＋-K＋-ATP酶测定试剂盒及考马斯亮蓝蛋白质含量测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；Wistar大鼠144只，雌雄各半，体重210g±20g，黑龙江省中医药大学实验动物中心提供。

1.2 试验方法及动物分组 所有的大鼠腹腔注射XFM 0.05mL／10g进行麻醉，然后再随机取72只为生理盐水组，其余为试验组，且生理盐水组和试验组又分为早期、中期和晚期催醒组。大鼠分别于注射XFM 后10、30、60min再腹腔注射0.05mL／10 g小型猪特异性麻醉颉颃剂或0.05mL／10g生理盐水。大鼠分别于翻正反射恢复期（催醒Ⅰ组或对照Ⅰ组）及可直线爬行时（催醒Ⅱ组或对照Ⅱ组）各剖杀取材。在生理盐水冰面上取脑，用4℃生理盐水将脑上的血迹冲洗干净，迅速分离双侧大脑皮层、海马、小脑、脑干、丘脑，立即液氮冷冻。

从液氮罐中将不同脑区的脑组织取出，称重后按1∶9（W／V）置入预冷的生理盐水溶液中匀浆，然后按差速离心法分离不同脑区脑突触体。首先1000r／min离心10min，收集上清液，沉淀用生理盐水溶液混悬后再按上述方法离心，收集上清液，合并两次上清液，然后以17000r／min离心55min，弃去上清液，即获粗制突触体。用相同缓冲液调成2g／L的粗制突触体混悬液，待测ATP酶活性。所有操作均在4℃下进行。采用比色法测定Na＋，K＋-ATP酶活性。酶活力以每小时分解每毫克组织蛋白产生的无机磷的含量（μmol／mg·h）表示。按考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

2 结果与分析

2.1 大鼠行为学变化 注射小型猪特异性麻醉颉颃剂后，各试验组的大鼠均表现出呼吸加快、摇头和排尿等现象，给予一定的刺激后大鼠可出现体动，随后开始四肢抖动，然后恢复翻正反射。翻正恢复后，大鼠可以进行斜线爬行或转圈运动，最后大鼠可进行直线爬行。注射小型猪特异性麻醉颉颃剂可以明显的缩短大鼠的翻正反射恢复时间和直线爬行恢复时间，与对照组相比，差异极显著（P＜0.01）。具体结果见表1。

表1 小型猪特异性麻醉颉颃剂对大鼠行为学变化情况（min±SD）

表1 小型猪特异性麻醉颉颃剂对大鼠行为学变化情况（min±SD）

注：①组方内数据比较：＊＊代表与0min比较P＜0.01，差异极显著；＊代表与0min比较P＜0.05，差异显著。②同一时间点组方间数据比较：肩标小写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）；大写不同表示差异显著（P＜0.05）；字母相同且大小写也相同表示差异不显著（P＞0.05）。下表同

翻正反射恢复时间 直线爬行恢复时间早期 对照组69.83±7.56 73.31±12.33催醒组 试验组 5.68±1.17＊＊Aa 8.19±1.99＊＊Aa中期 对照组45.54±11.53 49.78±13.32催醒组 试验组 5.71±1.82＊＊Aa 8.47±2.85＊＊Aa晚期 对照组20.87±5.46 24.60±6.56催醒组 试验组 5.31±0.59＊＊Aa 8.38±1.34＊＊Aa

2.2 小型猪特异性麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区Na＋，K＋-ATP酶活性的影响 早期催醒的催醒Ⅱ组大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干的Na＋，K＋-ATP酶活性分别较催醒Ⅰ组增加了57.89%（P＜0.01）、60.34%（P＜0.01）、75.23%（P＜0.01）、42.98%（P＜0.01）和33.06%（P＜0.01）。催醒Ⅰ组脑干较对照Ⅰ组增加了26.53%（P＜0.01）。催醒Ⅱ组大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干分别较对照Ⅱ组增加了22.45%（P＜0.01）、14.81%（P＜0.01）、38.41%（P＜0.01）、35.16%（P＜0.01）和25.00%（P＜0.01）。

中期催醒的催醒Ⅱ组大脑皮层、海马、丘脑和小脑的Na＋，K＋-ATP酶活性分别较催醒Ⅰ组增加了83.81%（P＜0.01）、48.00%（P＜0.01）、45.74%（P＜0.01）和38.83%（P＜0.01）。催醒Ⅰ组海马和小脑分别较对照Ⅰ组降低12.59（P＜0.01）和18.25%（P＜0.01）；而丘脑和脑干分别较对照Ⅰ组升高了8.40%（P＜0.01）和16.50%（P＜0.01）。催醒Ⅱ组大脑皮层、海马和丘脑相比对照Ⅱ组高了27.81%（P＜0.01）、8.19%（P＜0.01）和33.33%（P＜0.01）。

晚期催醒的催醒Ⅱ组大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干的Na＋，K＋-ATP酶活性分别较催醒Ⅰ组增加了88.89%（P＜0.01）、59.50%（P＜0.01）、33.57%（P＜0.01）、10.11%（P＜0.01）和41.07%（P＜0.01）。丘脑、小脑和脑干的Na＋，K＋-ATP酶活性在催醒Ⅰ组分别较对照Ⅰ组增加13.82（P＜0.01）、42.40%（P＜0.01）和13.13%（P＜0.05）；而大脑皮层和海马的催醒Ⅰ组分别较对照Ⅰ组减少15.38%（P＜0.01）和15.97%（P＜0.01）。催醒Ⅱ组大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干分别较对照Ⅱ组25.50% （P＜0.01）、15.57% （P＜0.01）、37.50%（P＜0.01）、47.37%（P＜0.01）和12.86%（P＜0.01）。试验结果见表2。

表2 小型猪特异性麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区Na＋，K＋-ATP酶活性的影响 （μmol／mg·h）

表2 小型猪特异性麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区Na＋，K＋-ATP酶活性的影响 （μmol／mg·h）

大脑皮层 海马 丘脑 小脑 脑干早期催醒组对照Ⅰ组 1.13±0.08DEcd 1.49±0.05Ccd 1.20±0.04Ecd 1.18±0.09Gf 0.98±0.07Gf对照Ⅱ组 1.47±0.09Cb 1.62±0.09Bbc 1.38±0.04Bb 1.28±0.08DEFdef 1.32±0.09BCbcd催醒Ⅰ组 1.14±0.05DEcd 1.16±0.06De 1.09±0.05Fd 1.21±0.04FGef 1.24±0.06CDcde催醒Ⅱ组 1.80±0.07Ba 1.86±0.06Aa 1.91±0.06Aa 1.73±0.06Bb 1.65±0.07Aa中期催醒组对照Ⅰ组 1.11±0.02DEcd 1.43±0.07Cd 1.19±0.06Ecd 1.26±0.03EFGdef 1.03±0.02FGf对照Ⅱ组 1.51±0.03Cb 1.71±0.03Bb 1.41±0.02Bb 1.36±0.02CDcd 1.35±0.09Bbc催醒Ⅰ组 1.05±0.04EFcd 1.25±0.03De 1.29±0.05CDbc 1.03±0.03Hg 1.20±0.05DEde催醒Ⅱ组 1.93±0.04Aa 1.85±0.03Aa 1.88±0.05Aa 1.43±0.03Cc 1.22±0.05CDEcde晚期催醒组对照Ⅰ组 1.17±0.03Dc 1.44±0.08Cd 1.23±0.02DEc 1.25±0.03EFGdef 0.99±0.05Gf对照Ⅱ组 1.49±0.08Cb 1.67±0.07Bb 1.36±0.07BCb 1.33±0.03DEcde 1.40±0.03Bb催醒Ⅰ组 0.99±0.03Fd 1.21±0.04De 1.40±0.03Bb 1.78±0.02Bb 1.12±0.02EFef催醒Ⅱ组 1.87±0.06ABa 1.93±0.06Aa 1.87±0.07Aa 1.96±0.06Aa 1.58±0.05Aa

3 讨论

神经系统分布有较高的Na＋，K＋-ATP酶，对维持神经细胞的兴奋性和传导性、调控神经递质的释放和信息传递有重要作用，因此Na＋，K＋-ATP酶活性的降低必然影响突触的化学传递作用及神经的传导功能［3］。

有研究发现，XFM的全麻作用与抑制特定脑区突触体Na＋，K＋-ATP酶活性相关。大脑皮质、丘脑、小脑和脑干的Na＋，K＋-ATP酶可能是XFM全麻作用的靶位之一［4］。在本试验中，早、中、晚期催醒的催醒Ⅰ组海马和催醒Ⅱ组大脑皮层的Na＋，K＋-ATP酶活性均表现出先升高再降低的趋势，即Na＋，K＋-ATP酶的活性在早期催醒时最低，在中期催醒时最高，且Na＋，K＋-ATP酶活性的这种变化趋势与大鼠行为学的变化相一致。分析试验结果，推断大脑皮质和海马的Na＋，K＋-ATP酶可能是小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒作用的靶位之一，且小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒作用可能与增加这两个脑区的Na＋，K＋-ATP酶活性相关。

海马的Na＋，K＋-ATP酶大鼠在恢复翻正反射时发挥主要作用，这是因为海马是中枢神经边缘系统的一部分，在组织学结构上属于古皮层，由三层神经元构成，其中颗粒细胞或锥体细胞是投射神经元，它们之间构成的三突触通路是研究药物对突触信号传递和神经元电活动影响的经典途径［5-6］。因此，小型猪特异性麻醉颉颃剂增加海马的Na＋，K＋-ATP酶才会促使大鼠恢复翻正反射。在我们的研究中同时还发现，大脑皮层的Na＋，K＋-ATP酶大鼠在恢复直线爬行时发挥主要作用。大脑皮层含有大量的与运动有关的神经元，在意识和感觉的调控中起着重要的作用［7］。小型猪特异性麻醉颉颃剂通过增加Na＋，K＋-ATP酶的活性，激活大脑皮层上的运动神经元。

然而，研究小型猪特异性麻醉颉颃剂的催醒机理是一个非常复杂的过程，涉及跨膜细胞信号转导、细胞内信息转导和离子通道等方面内容。研究Na＋，K＋-ATP酶活性只是在跨膜细胞信号转导某一方面揭示小型猪特异性麻醉颉颃剂的催醒机理，其必然还有更为复杂的分子机理不为我们所知，这需要进行更为深入和全面的研究。

4 结语

大脑皮质和海马突触体的Na＋，K＋-ATP酶可能是小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒作用的靶位之一，且小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒作用可能与增加这两个脑区的Na＋，K＋-ATP酶活性相关。

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